Методика иммунохимического исследования парапротеинов - принципы
Иммунохимическое исследование, проводимое при подозрении на наличие моноклональной секреции, представляет собой комплексный анализ, состоящий из двух этапов.
На этапе скрининга проводят электрофоретическое исследование сыворотки и концентрированной мочи, а также определяют количество иммуноглобулинов основных трех классов (G, А, М) и соотношение к/h. В типичных случаях, которые характеризуются высоким уровнем моноклональной секреции (особенно IgG и IgA) и снижением содержания по-ликлональных иммуноглобулинов, такого объема исследований достаточно для выявления и характеристики парапротеина.
Если уровень секреции невысок или по результатам скрининг-тестов не все ясно, то с учетом данных, полученных на первом этапе, планируют продолжение исследования с применением других методов, прежде всего ИФ и ИЭФ.
Выявление М-градиента — ключевой момент при диагностике моноклональной секреции, поэтому для проведения электрофореза должен быть выбран вариант с высокой чувствительностью и хорошим разрешением. Этим требованиям отвечает электрофорез в геле агарозы. Трудности при выявлении М-градиента могут быть связаны с несколькими моментами.
Прежде всего при низком содержании парапротеина М-градиент может быть не виден или слегка заметен на электрофореграмме. Кроме того, часть М-градиентов, особенно образованных белками Бенс-Джонса и А-парапротеинами, мигрирует в зоне а- и р-глобулинов и может маскироваться нормальными белками этих зон. В ряде случаев на электрофореграмме выявляются так называемые ложные М-градиенты, образование которых связано с высоким содержанием белков неиммуноглобулиновой природы.
Например, С-реактивный белок может давать небольшую гомогенную полосу в центре у-зоны. Лизоцим обусловливает образование небольшого градиента в зоне медленных у-глобулинов, что встречается при хроническом моноцитарном лейкозе. Полоса фибриногена при исследовании плазмы или при нарушениях свертывания крови может имитировать М-градиент в у1-зоне. Резкое повышение уровня а2-макроглобулина может быть ошибочно принято за М-градиент в а2-зоне. Наконец, наличие свободного гемоглобина в гемолизированном образце ведет к появлению интенсивной полосы в зоне b1-глобулинов.
Дополнительную полосу в зоне b-глобулинов дают также генетические варианты трансферрина. Большое количество крупных иммунных комплексов и наличие криоглобулинов вызывают образование нерастворимого осадка в области стартовой лунки, что также может быть ошибочно расценено как М-градиент. Во всех этих ситуациях используют иммунохимические методы, чаще всего иммунофорез, которая в большинстве случаев позволяет прояснить картину.
При подозрении на моноклональную секрецию обязательно электрофоретическое исследование концентрированной мочи, даже если общепринятыми биохимическими методами протеинурия не выявлена. Дело в том, что при выявлении протеинурии из-за низкой чувствительности биохимических реакций не всегда удается обнаружить белок Бенс-Джонса. Термопреципитация в кислой среде, которая считается качественной пробой на присутствие этого белка, также малочувствительна и неспецифична, поэтому результаты часто бывают ложными.
Электрофорез концентрированной мочи, сопровождаемый в случае необходимости иммунохимическим исследованием, обладает наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении парапротеинурии и, кроме того, позволяет охарактеризовать тип протеинурии.
При клинических проявлениях криоглобулинемии необходимо сразу после взятия крови поместить пробирку в термостат при температуре 37 С и инкубировать до полного образования сгустка, иначе криоглобулин, в состав которого может входить моноклональный белок, будет утерян. Криоглобулины, имеющие клиническое значение, образуют преципитат при температуре 4 °С уже через 12—24 ч. Если криопреципитат появляется через 4—7 дней, то клинические проявления маловероятны.
Определенной проблемой является измерение уровня парапротеина в сыворотке крови и моче. В настоящее время оптимальным методом считается денситометрия фореграмм, поскольку прибор дает возможность выделить пик, соответствующий М-градиенту, и рассчитать содержание в нем белка. Нефелометрия также может быть использована для определения уровня парапротеина. Однако следует помнить, что этот метод позволяет установить только суммарное количество парапротеина и поликлональных иммуноглобулинов того же класса, поэтому при успешной терапии, когда количество парапротеина снижается, а уровень поликлональной секреции повышается, данные нефелометрического исследования относительно изменения уровня парапротеина менее достоверны, чем результаты денситометрии.
При повторных обследованиях одного и того же больного не следует менять метод определения.
Радиальная иммунодиффузия в связи с особенностями, подробно рассмотренными ранее, не рекомендуется для определения уровня парапротеинов.
Направление и глубина диагностического поиска при иммунохимической диагностике в немалой мере обусловливаются особенностями клинической картины и данными предварительного лабораторного исследования. В связи с этим в направлении на иммунохимическое исследование необходимо указывать те изменения, по поводу которых данное исследование предпринимается.
