а) Введение и определения. Существует значительная клиническая потребность в разработке методов, способствующих регенерации поврежденных или пораженных тканей и органов. Эта потребность возникает вследствие большого количества травм, ВПР, ишемии и дегенеративных процессов, что становится все более актуальным по мере роста количества населения мира и его старения.
ЗНО взаимосвязаны с этой сферой как напрямую (восполнение утраченной функции жизненно важных органов в результате инвазии пораженных клеток или методы лечения, доставка противораковой иммунной и генной терапии с использованием клеток), так и косвенно (например, роль стволовых клеток в патогенезе ЗНО и риск онкогенеза при терапии с использованием стволовых клеток).
Недавние разработки в биологии стволовых клеток, молекулярных технологиях, биополимерах и других близких биологических и инженерных дисциплинах проложили путь к перспективным исследованиям и развитию клинической дисциплины — регенеративной медицине.
Прогресс в сфере генной терапии способствовал развитию двух стратегий: генной терапии ex vivo и in vivo. Метод генной терапии ex vivo (комбинированная стратегия клеточной и генной терапии) включает первоначальный сбор клеток у данного пациента с последующей генетической модификацией этих клеток в лаборатории. Затем генетически модифицированные клетки отбирают, наращивают их количество и возвращают тому же пациенту в попытке достичь желаемого терапевтического эффекта.
Эта стратегия особенно перспективна для генетической модификации стволовых клеток, которые восстанавливают соответствующие ткани, органы и системы органов после трансплантации. Наиболее известный пример — использование гемопоэтических стволовых клеток в исследованиях генной терапии для лечения нарушений кроветворения.
Подход генной терапии in vivo, напротив, включает доставку соответствующего трансгена (посредством использования различных векторов) непосредственно в ткань-мишень с последующей стабильной или временной экспрессией трансгена в соответствующих клетках. Экспрессия трансгена в соответствующих клетках или тканях достигается за счет комбинации локализованной доставки (инъекции), определенного тропизма вектора, используемого для интересующей ткани, и экспрессии трансгена под контролем клетки или тканеспецифичного промотора.
В ранних исследованиях генной терапии для доставки генетического материала использовали аденовирусные векторы и ретровирусные векторы на основе вируса мышиного лейкоза Moloney. Однако после летального исхода, вызванного токсичностью аденовирусного вектора (использованного для введения трансгена карбамилазы в этом конкретном исследовании), и случаев лейкемии у пациентов с Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (при активации LMO2, онкогена на хромосоме 11, из-за инсерционного мутагенеза, связанного с вектором вируса мышиного лейкоза) исследования приостановлены.
Поэтому эти векторы заменили на аденоассоциированный вирусный и лентивирусные векторы соответственно, в настоящее время проходят клинические исследования. В определенных условиях применяются другие вирусные векторы. Например, в генной терапии для устранения боли используется дефектный по репликации вектор ВПГ благодаря его тропизму к нервным тканям, а различные онколитические вирусы с приоритетным тропизмом к клеткам ЗНО используются для генной терапии ЗНО.
Некоторые вирусы, такие как вирус псевдочумы птиц (активирует врожденный или адаптивный иммунный ответ), реовирус (активирует протеинкиназы хозяина для прекращения выработки белка) и вирус эпидемического паротита, обладают характерной для них способностью специфически воздействовать на клетки ЗНО и при репликации вируса вызывают значительную гибель клеток и регресс опухоли. Другие вирусы (ВПГ, аденовирус, вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита и полиовирус) должны быть генетически модифицированы, чтобы вызвать онколитическую активность.
Генно-инженерные вирусы и по своей природе противоопухолево-селективные вирусы тестируются в ранних и поздних клинических состояниях, таких как метастатическая меланома и различные ЗНО ГМ.
1. Регенеративная медицина. Регенеративная медицина направлена на использование обширных возможностей замены или восстановления утративших функцию клеток, тканей или органов с целью восстановления нормальной функции. Таким образом, она опирается на три традиционных столпа медицинской терапии (фармацевтические ЛП, биологические ЛП и ИМН), а также на новейшую технологическую платформу — клеточную терапию. Традиционные методы лечения направлены на изменение естественного течения болезни или обеспечение контроля симптомов, долгосрочная цель регенеративной медицины — излечение болезни заменой утраченных функций тканей и органов.
2. Клеточная терапия. Клеточная терапия — применение клеток для достижения терапевтического эффекта, независимо от типа клеток или клинических показаний. Хотя достижение регенерации тканей и органов за счет замены клеток — важная цель технологии клеточной терапии, ее применение выходит за рамки области регенеративной медицины. Спектр применений клеточной терапии варьирует от кратковременных или постоянных методик замещения клеток до достижения иммуномодулирующих эффектов (например, для предотвращения реакции «трансплантат против хозяина»); действия в качестве носителей для доставки генов или генных продуктов (стратегии генной терапии с использованием клеток) и генно-инженерных методов противораковой терапии с использованием клеток.
В этой статье на сайте мы сосредоточимся на использовании клеточной терапии для регенеративной медицины и, в частности, возможной роли различных типов стволовых клеток в решении этой проблемы.
- Стволовые клетки. Стволовые клетки обладают двумя определяющими свойствами: способностью к самообновлению и способностью дифференцироваться в типы клеток со специализированными клеточными функциями (рис. 1). Это происходит на уровне отдельных стволовых клеток в процессе асимметричного деления клеток или на уровне популяции клеток, где дифференцируется подмножество клеток, а оставшиеся стволовые клетки остаются дремлющими или реплицируются как стволовые клетки.
Рисунок 1. Асимметричное деление клеток. Хотя первая характеристика считалась обязательной для стволовых клеток, исходя из их первоначального описания в кроветворной системе взрослых, не все типы клеток, в настоящее время называемых стволовыми клетками, проявляют это свойство. Например, стволовые клетки эмбриона человека делятся симметрично
После асимметричного деления клеток производные нестволовых клеток либо генерируют пул ограниченных системой органов, транзитных амплифицирующих клеток с повышенной пролиферативной способностью, либо продолжают дифференцироваться за счет эпигенетических изменений и изменений профиля экспрессии генов до достижения окончательно дифференцированного состояния. Эта концептуальная основа была разработана после открытия клеток костного мозга, способных восстанавливать систему кроветворения взрослых.
Гемопоэтические стволовые клетки составляют основу трансплантации, единственной формы терапии стволовыми клетками, которая в настоящее время широко применяется в клинической практике.
Различные типы стволовых клеток классифицируются на основе экспрессируемых ими белков или факторов транскрипции, а также по трем основным дополнительным характеристикам: способность к репликации (ограниченная или неограниченная); объем или способность к дифференцировке (например, плюрипотентная, мульти-потентная, олигопотентная, унипотентная); место в анамнезе жизни организма (в период развития или после развития).
Таким образом, более поздняя терминология расширила использование термина «стволовые клетки», охватывая более широкий спектр типов клеток, которые обеспечивают развитие органов или обладают способностью сформировать ткани и системы органов.
Термин «стволовые клетки» вместе с упомянутыми выше формулировками применяется для описания определенных клеточных субпопуляций, которые могут быть ответственными исключительно за рост ЗНО. Поскольку раковые стволовые клетки не играют никакой роли в регенерации тканей, они обсуждаются в отдельной статье на сайте - просим Вас пользоваться формой поиска по сайту выше.
1) Региональные (постнатальные) стволовые клетки. Считается, что после рождения многие ткани содержат субпопуляцию клеток со способностью к расширенному самообновлению в сочетании со способностью дифференцироваться в более зрелые типы клеток со специализированными функциями (рис. 2). Региональные стволовые клетки, которые составляют <0,01% от общего числа клеток, расположены в специализированных поддерживающих компартментах различных областей кроветворной системы и других местах и реагируют на сигналы в своем локальном микроокружении.
Рисунок 2. Стволовые клетки взрослого организма. Стволовые клетки взрослого организма могут быть мультипотентными и способными дифференцироваться в незначительное количество различных типов клеток, часто ограниченных данной тканью или системой органов, как в случае взрослых гемопоэтических или эпидермальных стволовых клеток. Из костного мозга взрослого человека выделены два типа стволовых клеток — гемопоэтические стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки. Мезенхимальные стволовые клетки костномозгового происхождения взрослого человека не достигают плюрипотентности, хотя было показано, что диапазон их дифференцировки шире, чем у любого другого типа стволовых клеток взрослого организма. Считается, что в некоторых системах органов, таких как эпителий желудочно-кишечного тракта, существует унипотентный пул предшественников для репопуляции быстро обновляющегося пула только одного типа клеток, хотя отсутствует определенность в понимании, отличимы ли такие предшественники от общей популяции полностью дифференцированных клеток в тканях с высокой клеточной регенерацией
Успешная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в лечении недостаточности костного мозга или в сочетании с миелоаблативной терапией при ЗНО побудила ученых к поиску региональных стволовых клеток в других органах. Сообщалось, что к зрелым тканям и системам органов, содержащим предполагаемые стволовые клетки, относятся костный мозг (гемопоэтический и мезенхимальный отделы) и периферическая кровь, эндотелий кровеносных сосудов, пульпа зуба, эпителий кожи, жировая ткань, пищеварительная система, роговица, сетчатка, яички и печень.
Подобные стволовые клетки или клетки-предшественники также были зарегистрированы в органах, которые традиционно не считались содержащими такие клетки, — ЦНС и почки.
Неясно, представляют взрослые стволовые клетки остатки онтогенетических стволовых клеток, которые сохраняются во взрослой жизни для поддержания и восстановления органов, или отдельный тип клеток, предназначенный для этой последней цели. Во многих органах, несмотря на присутствие таких тканеспецифических стволовых клеток, их регенерационная способность все еще недостаточна для борьбы с массовой потерей клеток, возникающей, например, после ишемического повреждения ГМ.
2) Эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В отличие от региональных стволовых клеток, обладающих относительно ограниченной способностью к дифференцировке, клетки в развивающемся доимплантационном эмбрионе сохраняют способность дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы), в конечном итоге способствуя развитию всех тканей организма (см. рис. 2). При нормальном развитии такие клетки не сохраняются после стадии бластоцисты.
При выделении изолята от неиспользованных доимплантационных бластоцист, созданных для оплодотворения in vitro, полученные клетки эмбриобласта могут быть использованы для создания линий стволовых клеток человеческого эмбриона (рис. 3). В недифференцированном состоянии созданные линии стволовых клеток человеческого эмбриона демонстрируют неограниченное самообновление в культуре клеток, сохраняя при этом способность дифференцироваться в производные клеток всех трех зародышевых листков, фактически давая начало в организме любому типу клеток.
Рисунок 3. Эмбриональные стволовые клетки. Тотипотентность — способность дифференцироваться во все типы клеток организма, включая экстраэмбриональные ткани, плаценту и пуповину, свойство, присущее самой оплодотворенной яйцеклетке, в том числе клеткам, полученным от первых нескольких клеточных делений после оплодотворения. Плюрипотентность — способность дифференцироваться во все специализированные типы клеток, производные от трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы, эндодермы) растущего эмбриона, и отличительная характеристика эмбриональных стволовых и зародышевых клеток
С помощью накопленного в эмбриологии опыта ученым удалось использовать последовательное применение различных комбинаций факторов роста для достижения эффективных систем дифференцировки из линий стволовых клеток человеческого эмбриона очищенных популяций разных типов нейронов, глиальных клеток, кардиомиоцитов, эндотелия сосудов и гладкомышечных клеток, β-клеток ПЖЖ, гепатоцитов, различных клеток крови (тромбоцитов, эритроцитов) и ряда других последовательностей клеточных поколений.
Одно из ограничений технологии получения линий стволовых клеток человеческого эмбриона — невозможность получить такие клетки от взрослого человека, что препятствует их использованию индивидуально для каждого пациента. Эти ограничения возможно преодолеть с помощью введения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Этот подход позволяет перепрограммировать взрослые соматические клетки (например, фибробласты или клетки крови) в плюрипотентные стволовые клетки путем введения набора факторов транскрипции, связанных с плюрипотентностью.
Созданные таким образом человеческие плюрипотентные стволовые клетки затем можно стимулировать к дифференцировке в различные типы клеток, используя протоколы дифференциации, подобные тем, которые уже используются для линий стволовых клеток человеческого эмбриона. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки создаются индивидуально, эта технология может быть применена для разработки упреждающих иммунологическое отторжение методов замены аутологичных клеток, для создания моделей различных специфичных для пациента или заболевания генетических нарушений, для оптимизации индивидуальных видов терапии, с целью обеспечения скринингов для допинг-контроля и поиска новых ЛП (рис. 4).
Рисунок 4. Применение технологии получения человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Индивидуальные для каждого пациента человеческие плюрипотентные стволовые клетки формируются за счет перепрограммирования взрослых соматических клеток (фибробластов) с помощью набора факторов транскрипции, а затем стимулируется их дифференцировка в различные клеточные линии. Затем специфичные для пациента человеческие плюрипотентные стволовые клетки трансплантируют обратно пациенту аутологичным способом для сфер применения регенеративной медицины. Аналогичным образом можно создать модели человеческих плюрипотентных стволовых клеток наследственных заболеваний, специфичные для болезни и пациента («модели болезни в тарелке»), и использовать их для получения более полного представления о генетических нарушениях, для изыскания новых лекарственных средств и для оптимизации индивидуальных видов терапии. Методы редактирования генов используют для коррекции мутаций и трансплантации здоровых клеток
б) Методы клеточной терапии в регенеративной медицине. Клеточная терапия широко распространена: переливание крови и фракций крови, трансплантация органов, ЭКО и трансплантация костного мозга. Тем не менее, помимо вышеупомянутых видов терапии, которые стали основой лечения в нескольких областях медицины, дополнительные подходы клеточной терапии считаются исключительно экспериментальными и все еще находятся на разных стадиях доклинической и клинической разработки. Выделяют семь различных методов (рис. 5).
Рисунок 5. Концептуальная схема принципов регенеративной медицины. Принципы разделены на направленные на усиление эндогенной регенерации и направленные на трансплантацию клеток. Первое может быть получено за счет активации предполагаемых тканеспецифичных стволовых клеток или клеток-предшественников, индукции размножения клеток, прямого перепрограммирования на основе фактора транскрипции in vivo (прямого преобразования одной соматической клетки — фибробласта в другую) и несколькими другими косвенными способами (модуляция воспаления, индукция ангиогенеза, трофический эффект, защита подверженной риску ткани и т.д.). Источники клеток, используемые для трансплантации клеток, включают ткани плода (например, насыщенная дофаминергическими клеточными телами вентральная область среднего мозга плода для лечения болезни Паркинсона), клеточные популяции, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (линии стволовых клеток человеческого эмбриона, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки), и соматические клетки, которые могут быть созданы ex vivo путем прямого перепрограммирования фибробластов на основе факторов транскрипции. Совсем недавно доставка внеклеточных везикул, полученных из таких источников клеток, была предложена в качестве потенциальной альтернативы клеточной терапии. Наконец, в качестве метода тканевой инженерии вышеупомянутые источники клеток можно объединить с биополимерами
1. Доставка стволовых клеток или клеток-предшественников, выделенных из костного мозга и крови. В последнее десятилетие проводился ряд исследований по оценке способности гемопоэтических или мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, восстанавливать ткань после доставки в различные органы. Эти исследования изначально основывались на предположении, что типы взрослых стволовых клеток проявляют некоторую степень пластичности, что позволяет им трансдифференцировать в надлежащие типы клеток (такие как клетки сердца, нервные клетки и клетки печени) после трансплантации в условиях соответствующей ткани.
Хотя степень такой трансдифференцировки незначительна, многие из этих исследований способствовали улучшению доставки стволовых клеток в разные органы. В настоящее время предполагается, что клиническая польза может быть связана с секрецией пересаженных клетками различных факторов роста («паракринная гипотеза»), которые усиливают эндогенные механизмы восстановления ткани, улучшают васкуляризацию ткани, модулируют воспаление и защищают ткани, находящиеся в зоне риска.
2. Доставка внеклеточных везикул. Внеклеточные везикулы — внутренние медиаторы межклеточной коммуникации в организме, обеспечивают функциональный перенос биомолекул (липидов, белков и нуклеиновых кислот), таких как ДНК, мРНК, микроРНК и других некодирующих РНК, при культивировании клеток in vitro или в различных жидкостях организма in vivo, таких как кровь, моча, слюна и СМЖ. Были предприняты попытки разделить внеклеточные везикулы на группы по их размеру или по механизмам образования и высвобождения. К ним относятся апоптотические тельца (1-5 мкм), микрочастицы (100-1000 нм) и экзосомы (<100 нм). Однако в недавних исследованиях сделаны выводы, что эти группы частично перекрываются.
Внеклеточные везикулы вызывают значительный научный интерес как с точки зрения понимания их разнообразной биологической роли в разных тканях, так и в качестве биомаркеров различных патологических состояний и переносчиков потенциальных терапевтических ЛС. Как отмечалось выше, многие типы стволовых клеток оказывают положительное влияние на восстановление/регенерацию тканей за счет паракринного эффекта. Внеклеточные везикулы, полученные из различных типов стволовых клеток/клеток, могут повторять терапевтические эффекты процедур трансплантации клеток.
Основополагающая гипотеза заключается в том, что внеклеточные везикулы стволовых клеток проявляют свое терапевтическое действие путем переноса биологически активных молекул, таких как белки, липиды, мРНК и микроРНК, от стволовых клеток к поврежденным или больным клеткам. Доставка внеклеточных везикул, а не самих клеток, обладает рядом преимуществ: сокращение затрат, более простое техническое производство и доставка, ограниченная иммуногенность. Текущие доклинические и клинические исследования оценивают эффективность таких процедур доставки внеклеточных везикул для регенерации/ восстановления тканей во многих органах.
Наконец, внеклеточные везикулы представляют собой новый подход к доставке ЛС, обеспечивающий высокую эффективность доставки, свойства внутренней направленности и низкую иммуногенность, предпринимаются попытки смоделировать их свойства (напрямую или путем модификации исходных клеток), чтобы придать этим средствам доставки уникальные свойства, адаптированные под специальные области применения.
3. Доставка или активация тканеспецифических стволовых клеток/клеток-предшественников или индукция пролиферации клеток. Ряд органов, ранее считавшихся не способными к какой-либо регенерации (например, ГМ, ПЖЖ, почки и сердце), на самом деле обладают такой способностью, пусть даже и в ограниченной мере. Остается не доказанным механизм подобной регенерации по каждому конкретному органу: наличие тканеспецифичных стволовых клеток или клеток-предшественников или репликационная способность окончательно дифференцированных клеток.
В последние годы предприняты значительные усилия по выделению предполагаемых тканеспецифичных стволовых клеток/клеток-предшественников, исходя из экспрессии общих или специфических маркеров стволовых клеток или на основе их уникальных свойств культивирования. Исследования затронули возможность клонального культивирования таких клеток и формирования одного или нескольких типов клеток, применимых к органам, из которых они были выделены. Современные работы по использованию вышеупомянутых результатов для регенеративной медицины сосредоточены либо на выделении, экспансии ex vivo и трансплантации предполагаемых стволовых клеток/клеток-предшественников обратно в их соответствующие нативные органы, либо на ↑ их эндогенного репаративного потенциала in vivo.
Первую стратегию можно проиллюстрировать на примере ЦНС, когда клетки-предшественники собирают, выращивают в культуре (как нейросферы) и формируют различные типы нейронов и поддерживающих глиальных клеток. Аналогичные исследования предпринимаются и для других систем органов. Второй подход, напротив, направлен на воздействие на предполагаемые ниши стволовых клеток в поврежденные органах с целью усиления эндогенных репаративных свойств стволовых клеток/клеток-предшественников. Такое воздействие лежит в основе потенциального лечебного эффекта стволовых клеток костного мозга после их доставки в разные органы.
Последняя стратегия направлена на ускорение восстановления эндогенных органов за счет репликации окончательно дифференцированных тканеспецифичных клеток. Она либо ↑ физиологические возможности данного органа (например, стимуляторы секреции инсулина для β-клеток ПЖЖ), либо вызывает репликацию в клетках, которые уже вышли из клеточного цикла. В отношении последнего метода следует проявлять осторожность, поскольку индукция неконтролируемой пролиферации (например, путем манипуляции с генами) ↑ риск онкогенеза.
4. Приживление тканей плода. Самый эффективный подход к восстановлению органов — замена отсутствующих клеток идентичными копиями. Выделение и культивирование клеток тканей взрослого человека для трансплантации может оказаться невозможным, если ткани имеют ограниченную регенеративную способность. Во время пренатального развития человека клетки фетального происхождения часто проявляют повышенную пролиферативную способность, а также способность дифференцироваться в более чем один тип зрелых или специализированных клеток. Более того, исследования на животных показали, что трансплантация тканей, взятых из растущих органов (собранных в определенный временной промежуток во время развития эмбриона), дает начало всем функционирующим органам, таким как почки, легкие и ПЖЖ.
В случае почек — успешное выделение размножающихся клеток-предшественников нефронов из зародышевых источников и их использование для замедления или остановки прогрессирования хронического повреждения почек в экспериментальных моделях, разработка протоколов для создания таких клеток-предшественников с помощью перепрограммирования клеток источников, не являющихся плодом, — следующий шаг исследования. На сегодняшний день единственными клетками эмбрионального происхождения, которые использовались в медицинской практике человека, являются дофаминергические клетки, полученные из развивающейся НС плода для лечения болезни Паркинсона.
Более широкому использованию тканей плода в регенеративной медицине мешает ограниченный доступ к таким клеткам по техническим и этическим причинам, аллогенный характер таких процедур (требующий подавления иммунитета) и возможность образования опухоли, как уже описано в некоторых отчетах о клинических случаях.
Болезнь Паркинсона включает потерю меланинсодержащих дофаминергических нейронов компактного слоя черной субстанции среднего мозга наряду с сопутствующим истощением запасов дофамина в полосатом теле. Этой потерей клеток обусловлены основные двигательные особенности болезни. В поисках более радикальной терапии, чем фармакология, применение заместительной клеточной терапии предполагало значительное улучшение моторной функции после интрастриатальной имплантации насыщенной дофамином мезэнцефальной ткани, полученной от абортированных плодов человека 6-9 нед. Требуется длительное иммуносупрессивное лечение для раскрытия функционального потенциала трансплантированных дофаминергических нейронов, вопреки представлению об иммунологическом резерве ГМ.
Предоставлены доказательства длительной выживаемости трансплантата, морфологической и функциональной интеграции и клинической пользы после терапии клетками фетального происхождения, которая длилась ≥10 лет у некоторых пациентов. Дальнейшее продвижение ограничивается отсутствием достаточного количества исходной ткани для лечения большого количества пораженных пациентов, неприемлемой вариабельностью функциональных исходов болезни, отчетами о серьезных дискинезиях у пролеченных пациентов и этическими соображениями.
Учитывая вышеупомянутые ограничения приживления тканей плода, производные стволовых клеток предлагают жизнеспособную альтернативу для лечения болезни Паркинсона путем замены дофаминергических нейронов или замедления процесса дегенерации и восстановления целостности нигростриатального пути за счет высвобождения трофических факторов. Дофаминергические нейробластоподобные клетки были получены ex vivo из различных источников стволовых клеток, в том числе из плюрипотентных стволовых клеток (линий стволовых клеток человеческого эмбриона и человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) путем прямого репрограммирования фибробластов, из нейральных стволовых клеток и предшественников из вентральной области среднего мозга эмбриона и взрослых нейральных стволовых клеток из субвентрикулярной зоны.
Доклинические исследования приживления продемонстрировали выживаемость в моделях болезни Паркинсона на животных и после созревания клеток оказывали благоприятные функциональные эффекты. Некоторые свойства, основополагающие для успешной трансляции, не были полностью реализованы в исследованиях по трансплантации на животных с использованием дофаминергических нейронов на основе стволовых клеток человека. Дополнительные проблемы — разработка методов предотвращения развития болезни разрушением трансплантированных нейронов (например, инженерия клеток для секреции нейротрофических факторов) и ограничение дискинезии, вызванной трансплантацией (например, путем минимизации количества серотонинергических нейробластов в трансплантированной ткани). Ожидается, что в ближайшем будущем начнутся первые клинические исследования производных плюрипотентных стволовых клеток человека для лечения болезни Паркинсона.
Первым типом клеток, который прошел клинические исследования при СН, были скелетные миобласты. Клетки (сателлитные клетки), отобранные для исследования аутологичным способом, размножают ex vivo и трансплантируют в сердце. Скелетные миобласты проявляют отличные от кардиомиоцитов физиологические свойства и не образовывают электромеханические связи с сердечной тканью реципиента → клинические усилия прекращены во многом из-за отсутствия эффективности, а также из-за наличия данных, свидетельствующих об ↑ аритмогенности у некоторых пациентов.
В отличие от клеток костного мозга, при дифференцировке ex vivo линии плюрипотентных стволовых клеток человека (линии стволовых клеток человеческого эмбриона и человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) могут стать кардиомиоцитами. В последние годы в результате научно-исследовательских работ на моделях ИМ на животных были определены эффективные системы направленной дифференцировки, которые дают начало клинически значимому количеству кардиомиоцитов (и даже специфичным для камер подтипам кардиомиоцитов, таким как миоциты желудочков или клетки, подобные синоатриальному узлу), и продемонстрирована способность создаваемых клеток приживаться, функционально интегрироваться с сердечной тканью реципиента и улучшать работу миокарда.
В 2015 г. Менаше (Menasche) и его коллеги сообщили о первом случае, когда человек с тяжелой СН во время операции АКШ получил лечение производными линий стволовых клеток человеческого эмбриона путем засевания ЛЖ клетками на основе сердечно-сосудистых клеток-предшественников. Тем не менее вопросы, связанные с этикой и аллогенной природой трансплантата (линий стволовых клеток человеческого эмбриона), с неэффективным и неполным процессом перепрограммирования человеческих плюрипотентных стволовых клеткок, с гетерогенными и относительно незрелыми свойствами созданных кардиомиоцитов, а также со сложными нормативными и финансовыми проблемами, все еще препятствуют широкомасштабному клиническому внедрению процедур клеточной терапии.
Помимо получения новых β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, достигнут прогресс в перепрограммировании типов клеток, близкородственных β-клеткам, путем сверхэкспрессии основных регуляторных факторов транскрипции. Первые исследования сосредоточены на превращении гепатоцитов в P-подобные клетки посредством сверхэкспрессии генов PDX1, фактора транскрипции MAFA и NeuroD. Трансдифференцировка ацинарных клеток мышей в β-клетки in vivo успешно выполнена благодаря временной вирусной сверхэкспрессии трех факторов транскрипции (PDX1, NGN3 и MAFA), сверхэкспрессия одного фактора транскрипции, РАХ4, благополучно преобразовала мышиные α-клетки в β-клетки.
5. Трансплантация ex vivo дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. В отличие от тканей плода, линии стволовых клеток человеческого эмбриона истинно плюрипотентные (дают начало модифицированным производным клеток всех трех зародышевых листков). Линии стволовых клеток человеческого эмбриона размножаются в недифференцированном состоянии и затем стимулируются к дифференцировке в различные типы клеток, давая начало потенциально неограниченному количеству специализированных типов клеток для трансплантации. Многочисленные доклинические исследования продемонстрировали способность производных линий стволовых клеток человеческого эмбриона приживаться, выживать и улучшать работу органов в широком спектре соответствующих моделей болезней на животных (СН, болезнь Паркинсона и другие нейродегенеративные нарушения, СД и т.д.).
Клинические исследования с использованием производных линий стволовых клеток человеческого эмбриона только начинаются: в настоящее время проводятся исследования на сетчатке (трансплантация клеток пигментного эпителия сетчатки), при повреждении спинного мозга (с использованием предшественников олигодендроцитов) и на сердце (с использованием клеток-предшественников сосудов на основе линий стволовых клеток человеческого эмбриона), а для ЦНС (болезнь Паркинсона с использованием дофаминергических клеток) и для лечения СД запланированы на будущее.
Несмотря на значительные достижения, полученные благодаря линиям стволовых клеток человеческого эмбриона, серьезные препятствия для их клинического использования создают невозможность формирования индивидуальных линий стволовых клеток человеческого эмбриона от взрослых пациентов — этические проблемы, возникающие в результате гибели человеческих эмбрионов, и предполагаемое иммунное отторжение, вызванное такой трансплантацией аллогенных клеток. Технология человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток обеспечивает потенциальное решение этих проблем.
Как уже отмечалось, собственные соматические клетки пациента (фибробласты, волосяные фолликулы, эпителиальные клетки мочи или клетки крови) могут быть перепрограммированы с помощью набора транскрипционных и химических факторов для получения плюрипотентных стволовых клеток. Затем у специфичных для пациента человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток стимулируют дифференцировку в различные клеточные линии, используя протоколы, аналогичные уже действующим для линий стволовых клеток человеческого эмбриона. В свою очередь, эти дифференцированные производные можно трансплантировать либо аутологичным, либо аллогенным способом.
Клинические исследования с использованием клеточных родословных на основе человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток либо начались недавно, например в случае макулярной дегенерации (клетки пигментированного эпителия сетчатки), либо, как ожидается, начнутся в ближайшие несколько лет с фокусированием на болезни Паркинсона (дофаминергические нейроны), переливания продуктов крови (тромбоциты и красные кровяные тельца) и СН (кардиомиоциты).
Одна из проблем при трансляции линий стволовых клеток человеческого эмбриона и человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в терапевтическую платформу — онкогенный риск. Проблема обусловлена способностью оставшихся недифференцированных клеток образовывать тератомы, использованием онкогенных факторов репрограммирования, случайной интеграцией вирусных векторов, применяемых в клеточном перепрограммировании («инсерционный онкогенез»), генетической нестабильностью, потенциально приводящей как к хромосомным аберрациям, так и к мутациям. Переход к клиническим исследованиям требует окончательного прояснения этого ключевого вопроса.
Другая проблема — предполагаемое иммунное отторжение, связанное с трансплантацией аллогенных клеток (требующее иммуносупрессии), а также нормативные, технические и финансовые препятствия, связанные с аутологичной трансплантацией. Для решения первой проблемы прилагаются усилия с использованием различных стратегий по формированию универсальных доноров индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
6. Прямое перепрограммирование. В отличие от подхода получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, который направлен вначале на перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентное состояние с последующей дифференцировкой созданных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в определенные клеточные популяции, недавно описанные стратегии прямого перепрограммирования ориентированы на прямое преобразование фенотипа одного типа зрелых клеток (фибробластов) в другой. Прототип такой стратегии — главный регулятор формирования скелетных мышц, преобразовывающий фибробласты напрямую в скелетные мышцы.
В отличие от скелетных мышц, для большинства клеточных популяций не были найдены отдельные главные гены — регуляторы развития → получение других типов клеток было отложено на много лет.
Опираясь на экспериментальный подход, используемый для определения комбинации факторов транскрипции, имеющих способность перепрограммировать соматические клетки в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, исследователи оценили возможность получения аналогичных стратегий перепрограммирования факторов транскрипции для прямого преобразования соматических клеток. Используя комбинацию линий специфических факторов транскрипции развития, ученые смогли напрямую преобразовать окончательно дифференцированные фибробласты или другие соматические клетки в нейроны, β-клетки, различные клоны кроветворных клеток и кардиомиоцитоподобные клетки.
Недавние исследования продвинули эту концепцию на шаг вперед, продемонстрировав, что трансдифференцировка на основе фактора транскрипции получается in vivo.
Они предложили метод, с помощью которого резидентные клетки (фибробласты, клетки печени или другие клетки) преобразовывались в соответствующие типы клеток для восстановления органов. Можно считать, что развитие такого подхода для клинического применения больше схоже с генной терапией в плане сопутствующей пользы, недостатков и проблем этой дисциплины.
7. Тканевая инженерия. Тканевая инженерия — междисциплинарная технология, сочетающая принципы медико-биологических наук и инженерии с целью разработки функциональных заменителей поврежденных тканей и органов. Вместо простого введения клеток в пораженную область в тканевой инженерии перед трансплантацией клетки подсаживаются или засеваются на трехмерные каркасы (полученные из различных биоматериалов). Независимо от конкретного клинического применения тканевая инженерия включает использование сочетаний биоматериалов, клеток и биологически активных факторов.
Каркас выполняет множество функций, включая контроль формы и размера приживленной ткани, доставку биологических сигналов и правильную биомеханическую опору клеток, индукцию васкуляризации трансплантата и защиту клеток от физического повреждения. Каркасы, используемые в методах тканевой инженерии, обычно делятся на две общие категории: клеточные каркасы, которые ex vivo засеваются клетками до трансплантации in vivo, и бесклеточные каркасы, которые зависят от повторного заселения каркаса клетками реципиента с его последующим восстановлением. Применяемые в тканевой инженерии каркасы уже прошли клинические исследования, подтверждающие правильность концепции.
Эти работы сосредоточены в основном в костно-мышечной системе (восстановление костей и хрящей), но также направлены на другие органы, например сердце и другие сложные структуры органов, такие как пищевод, трахея, мочевой пузырь.
в) Применение клеточной терапии при конкретных заболеваниях. Несмотря на то что растет число экспериментальных видов клеточной терапии, прошедших различные стадии клинических исследований, до сих пор ни одна из них не стала утвержденным или зарегистрированным видом лечения, за исключением вышеупомянутых гемопоэтических стволовых клеток и трансплантации твердых органов. Тем не менее ниже приведены примеры нескольких существующих работ по клеточной терапии, выполняемых в сфере нейродегенеративных заболеваний, СН и СД.
1. Нейродегенеративные заболевания. ЦНС имеет ограниченную способность восстанавливать утраченные ткани как при медленно прогрессирующих дегенеративных неврологических состояниях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или боковой амиотрофический склероз, так и при острых травмах, ведущих к быстрой потере клеток (например, ишемический инсульт, травматическое повреждение спинного мозга). Терапия на основе стволовых клеток рассматривается как потенциально новая терапевтическая парадигма как при острых, так и при хронических нейродегенеративных нарушениях.
С учетом описанных выше механизмов действий, относящихся к клеточной терапии, эти процедуры действуют через следующие механизмы: замещение клеток, при котором клетки (дифференцированные к определенным нейрональным или глиальным клеточным линиям) трансплантируются для замены погибших клеток определенных подтипов (например, дофаминергические нейроны при болезни Паркинсона, двигательные нейроны при боковом амиотрофическом склерозе или смесь различных нейрональных и глиальных подтипов при других заболеваниях); трофическая поддержка, при которой подсаженные клетки используются для активизации выживания пораженных нейронов или нейроглий или для стимуляции эндогенного восстановления пораженного участка за счет секреции нейротрофических факторов; и модуляция воспалительного процесса, который вносит вклад в патогенез многих нейродегенеративных процессов.
Первый механизм наиболее интересен, но его достижение — сложная задача, поскольку потребуется не только получить клинически значимое количество конкретных глиальных или нейрональных подтипов или комбинации этих клеток, но и доставить их в необходимый участок (локально или диффузно), а также обеспечить выживание клеточного трансплантата, его непрерывное и правильное функционирование и интеграцию с нейронной сетью хозяина.
Исследования методов на основе стволовых клеток для лечения других нейродегенеративных заболеваний, включая боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Баттена, инсульт, а также травмы ГМ и спинного мозга, в настоящее время переходят от исследований экспериментальных моделей на животных к планированию клинических исследований. Последние отчеты демонстрируют большую клиническую пользу моделей на животных по направленной дифференцировке и трансплантации линий стволовых клеток человеческого эмбриона и человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в пигментный эпителий сетчатки. В ряде стран начаты исследования применения этих клеток на людях для пациентов, страдающих макулярной дегенерацией.
2. Заболевание сердца. Хотя некоторые исследования поставили под вопрос убеждение, что сердце — дифференцирующийся до окончательной стадии орган, особенно на неонатальном этапе, эндогенные механизмы восстановления сердца взрослого человека несовершенны при обширном ИМ. Потеря миллиарда кардиомиоцитов (↓ сократительной массы) → клинической СН. СН — основная причина госпитализации; нехватка донорских органов ограничивает количество трансплантаций сердца во всем мире, неудивительно, что разнообразные работы регенеративной медицины сфокусированы на сердце.
Самый обширный клинический опыт в терапии поражений миокарда — использование стволовых клеток костного мозга (гемопоэтических стволовых клеток, а в последнее время также мезенхимальных стволовых клеток). Эффекты доставки таких клеток (в основном через коронарное кровообращение) были изучены на тысячах пациентов, например, в условиях острого или недавно перенесенного ИМ. Метаанализы ишемической или неишемической кардиомиопатии продемонстрировали противоречивые результаты: одни исследования предполагают умеренное улучшение функции ЛЖ, а другие показывают нейтральные результаты.
Самые последние работы в этой области сконцентрированы на попытках стимулировать зрелые кардиомиоциты повторно войти в клеточный цикл (непосредственно или после начальной фазы дедифференцировки) или преобразовать фенотип немиоцитов (фибробластов) в кардиомиоциты. С использованием последнего подхода продемонстрировано, что фенотип фибробластов мыши может быть преобразован как in vitro, так и in vivo в кардиомиоцитоподобные клетки путем экспрессии комбинации специфичных для кардиомиоцитов факторов транскрипции. Результатом становится ↑ количества кардиомиоцитов и улучшение сокращения поврежденного сердца. Исследования находятся на ранней стадии.
3. Сахарный диабет. Успешная трансплантация ПЖЖ и усовершенствованные протоколы для трансплантации клеток островков Лангерганса без сопутствующей терапии ГКС продемонстрировали не только восстановление контроля над концентрацией глюкозы у пациентов с СД, но также предотвращение или даже устранение некоторых осложнений болезни. Методы, основанные на трансплантации целого органа или островков, ограничены как иммунологическим отторжением, так и пределами доступного источника трансплантируемых тканей. Это побудило к поиску типов клеток, которые заместят (СД-1) или усилят недостаточную функцию β-клеток (СД-2).
Разработка линий стволовых клеток человеческого эмбриона и человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в сочетании с углубленным пониманием развития β-клеток — уникальный источник клеток для получения β-клеток для трансплантационной терапии. Опираясь на опыт эмбриологии, были разработаны эффективные протоколы, способствующие дифференцировке плюрипотентных клеток in vitro в предшественник или раннюю стадию фенотипа β-клеток. Эта область стала еще ближе к клиническому применению, решив задачу создания более зрелых и функциональных β-клеток. Этот подход сейчас проходит ранние клинические исследования с участием пациентов, получающих имплантаты предшественников ПЖЖ на основе линий стволовых клеток человеческого эмбриона, но детальные результаты исследований еще не опубликованы.
Одна из проблем использования β-клеток для заместительной клеточной терапии заключается в том, что аутоиммунное разрушение эндогенных β-клеток, лежащее в основе патогенеза СД-1, вероятно, вызывает и разрушение β-клеток, полученных из плюрипотентных клеток, даже если они берут начало из аутологичного (человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) источника. Предпринимаются усилия по разработке биотехнологических средств (технологий инкапсуляции) для доставки клеток в иммунопротекторную среду, которая предотвратит отторжение клеток, но сохранит способность подсаженных β-клеток распознавать глюкозу и выделять инсулин. Другая задача — сложное взаимодействие β-клеток с соседними клетками внутри островка ПЖЖ для правильного физиологического контроля метаболизма глюкозы.
Последняя регенеративная методика направлена на ↑ количества β-клеток ПЖЖ за счет индукции размножения существующих β-клеток. Этот терапевтический метод ориентирован на пациентов с СД-2, 4- нагрузку на существующие перегруженные β-клетки, но может быть полезным для некоторых пациентов с СД-1, у которых все еще сохранилось некоторое количество β-клеток. Новые β-клетки ПЖЖ образуются в результате размножения существующих β-клеток. Недавно определены перспективные варианты для наращивания размножения β-клеток, включающие использование активаторов глюкокиназы или бетатрофина, секретируемого печенью белка.
г) Платформы на основе стволовых клеток для моделирования заболеваний, персонализированной медицины и поиска новых лекарственных средств. Помимо создания клеток для восстановительных поврежденных органов, способность выращивать в культуре большое количество различных специализированных типов клеток — беспрецедентная возможность для открытия и тестирования генов и ЛС. Например, способность выращивать кардиомиоциты человека в культуре обеспечивает доклиническую экспериментальную платформу для скрининга недавно разработанных ЛС с точки зрения их способности вызывать удлинение интервала Q-T → риску аритмии в клинических условиях. Другой пример — создание экспериментального тканевого микроокружения человеческого происхождения для изучения отклика стромы на рост ЗНО и тестирования противоопухолевых ЛП, нацеленных на онкогенные реакции (ангиогенез).
Появление технологии человеческих плюрипотентных стволовых клеток произвело дальнейшую революцию в этой области, поскольку она впервые позволяет создавать модели человеческих плюрипотентных стволовых клеток для различных заболеваний/генотипов и пациентов с широким спектром наследственных заболеваний. Начальные исследования включали заболевания с моногенным наследованием, более поздние — заболевания с более сложными типами наследования.
Различные типы специфичных для пациента нейронов на основе человеческих плюрипотентных стволовых клеток: кардиомиоциты, скелетная мышца, клетки крови, гепатоциты и другие типы клеток воспроизводят в чашке для культивирования аномального фенотипа широкого спектра генетических нарушений, включая нейродегенеративные (такие как СМА, семейная дизавтономия, боковой амиотрофический склероз, шизофрения и даже заболевания с поздним началом, такие как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера), различные кардиомиопатии и аритмогенные синдромы, широкий спектр заболеваний крови и несколько других генетических нарушений.
Эти модели предоставили ценную информацию о механизмах, лежащих в основе этих болезненных состояний, и создали уникальные экспериментальные платформы, которые позволят тестировать существующие виды терапии с учетом специфики пациента (персонализированная медицина) для оценки развивающихся методов терапии («клинические исследования в чашке для культивирования»), а также разрабатывать новые стратегии МП.
д) Клеточная терапия при лечении злокачественных новообразований. В связи с тем, что в эти новые перспективные подходы входит генная инженерия клеток ex vivo, они будут рассмотрены в следующей статье на сайте под названием «Генная терапия» - просим Вас воспользоваться формой поиска по сайту выше, либо ссылкой ниже, где был переход на нее на момент подготовки данной статьи.
Видео стволовые клетки и овечка Доли - обман или бизнес
