Генная терапия — перенос генетического материала в клетки для восстановления или коррекции дисфункции клеток или для обеспечения новой функции клеток в попытке вылечить болезнь или как минимум улучшить клиническое состояние пациента. Использование генов в качестве терапевтических платформ появилось в середине XX вв„ а в 1990 г. в США были проведены первые зарегистрированные контролируемые исследования.
В первом клиническом исследовании четырехлетнюю девочку с дефицитом аденозиндезаминазы лечили путем трансфекции гена аденозиндезаминазы в лейкоциты → улучшению функционирования иммунной системы. С тех пор >10 000 пациентов привлечены к участию в большом количестве клинических исследований по использованию генной терапии, проведенных по всему миру.
Наиболее частые пациенты, на которых были направлены эти исследования, — больные ЗНО и пациенты с моногенными наследственными нарушениями (рис. 1). Изначально генная терапия зарождалась как способ терапии ALTE (ВПР, ЗНО), не поддающихся традиционному лечению, в настоящее время генная терапия осваивается для неопасных для жизни состояний, отрицательно влияющих на качество жизни пациента.
Рисунок 1. Исследования генной терапии. Распределение клинических испытаний генной терапии в соответствии с клиническим показанием и фазой исследования
Ранние клинические неудачи, ряд зарегистрированных смертей (только 2 из-за генной терапии), случаи лейкемической трансформации → генную терапию признали опасной и недоработанной. Однако недавние клинические успехи вселили новый оптимизм в потенциал этой дисциплины: новые программы в лечении синдромов первичного иммунодефицита, заболеваний крови и лейкодистрофий; улучшение зрения у пациентов с заболеваниями сетчатки; инновационные подходы к борьбе с хроническими вирусными инфекциями (например, ВИЧ); результаты экспериментальных и клинических исследований в лечении различных форм ЗНО.
Несмотря на эти успехи, в настоящее время одобрено и доступно лишь несколько методик генной терапии. У пациентов со СПИД для лечения ретинита, вызванного ЦМВ, используется фомивирсен (Витравен). В 2012 г. глибера стала первым ЛП для генной терапии, одобренным для клинического использования в Европе или США. Глибера использует вирус, вводимый пациенту, для доставки рабочей копии гена, вырабатывающего липопротеинлипазу, для лечения редкого наследственного заболевания, связанного с дефицитом липопротеинлипазы.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая опухолевый супрессор р53 в аденовирусном векторе, используется для лечения пациентов с ЗНО головы и шеи — зарегистрирована только в Китае. Генная инженерия ex vivo Т-лимфоцитов для экспрессии химерных АГн-рецепторов при лечении ЗНО показала весьма обнадеживающие результаты и получила одобрение FDA США для использования при определенных гематологических ЗНО у детей и молодых людей. Другие исследования находятся в стадии рассмотрения (см. ниже).
Аналогичным образом в 2016 г. FDA выдала разрешение на использование генной терапии ex vivo гемопоэтическими стволовыми клетками для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита с дефицитом аденозиндезаминазы. Терапия состоит из однократной инфузии аутологичных гемопоэтических стволовых клеток с генной коррекцией, готовится из гемопоэтических стволовых клеток собственного костного мозга пациента, которые генетически модифицированы с использованием γ-ретровирусного вектора для вставки функциональной копии гена аденозиндезаминазы.
а) Классификации и механизмы действия. Область применения соматической генной терапии можно разделить на нацеленные на лечение или коррекцию различных генетических нарушений и на негенетические заболевания путем попытки изменить функцию клеток, тканей и органов благоприятным образом. По данным ВОЗ, существует >10 000 заболеваний с моногенной наследственностью, но лишь небольшая часть из них поддается лечению генной терапией.
Традиционные работы по генной терапии наследственных заболеваний сосредоточены на экзогенной экспрессии генов, кодирующих отсутствующие или аномальные белки, и в меньшей степени на изменении паттернов аномальной экспрессии генов. Ожидается, что дальнейшие усилия позволят сместить акцент с неконтролируемой сверхэкспрессии отсутствующего белка на прямую коррекцию мутации на уровне ДНК (стратегии редактирования генов).
При негенетических нарушениях применение генной терапии направлено на сверхэкспрессию специфического белка в попытке оптимальным образом изменить клеточную функцию (например, ↑ сократительную способность при СН за счет сверхэкспрессии белков, связанных с обменом кальция), чтобы защитить ткани, подверженные риску (например, при ОПН), для оказания паракринных эффектов посредством локальной секреции специфических белков генно-инженерными клетками (например, для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях или для индукции нейротрофических эффектов при нейродегенеративных нарушениях), для системной секреции белков (например, в исследованиях генной терапии, направленных на коррекцию нарушений свертываемости крови путем секреции факторов свертывания или для системной доставки гормонов, таких как эритропоэтин, для лечения анемии).
Основные усилия в области генной терапии на сегодняшний день сосредоточены на иммунотерапевтических подходах к лечению ЗНО (см. ниже).
б) Методы доставки генной терапии. Средства генной терапии часто состоят из двух элементов: самого генетического материала (то есть кассеты экспрессии ДНК — наиболее часто используемая терапевтическая нагрузка, короткой интерферирующей РНК или антисмысловой нуклеотидной последовательности) и векторной системы доставки.
Последний элемент — более сложный и ограниченный, поэтому для любой генетической терапии выбирается наиболее эффективный метод доставки с учетом знаний о потенциальных побочных эффектах каждого типа вектора, таким образом подбирая терапию к конкретным клиническим ситуациям.
Для успешного переноса генов существуют трудноразрешимые препятствия: преодоление клеточной мембраны, выход из эндосомы, прохождение через ядерную оболочку и интеграция в геном хозяина. Разработанные для преодоления этих проблем векторы делятся на две обширных категории: невирусные и вирусные векторы.
Генная терапия, опосредованная невирусными векторами, называется трансфекцией и состоит из прямой доставки голой ДНК путем инъекции, использования липосом (катионных липидов, смешанных с нуклеиновыми кислотами), наночастиц и других средств. Хотя невирусные векторы могут быть получены в относительно больших количествах и представляют минимальные токсические или иммунологические проблемы, их основной недостаток — неэффективный перенос генов.
Кроме того, экспрессия чужеродного гена временная, что исключает их применение при многих болезненных состояниях, требующих устойчивой и высокой экспрессии трансгена.
Эффективность доставки невирусных векторов ↑ за счет использования различных физических методов, таких как электропорация (для четко ограниченных частей тела или областей: мышцы, кожа и ЗНО), генная пушка (для вакцинации ДНК) и ультразвуковая доставка (для ССЗ и ЗНО).
Генная терапия, опосредованная вирусными векторами, называется трансдукцией, и в большинстве исследований генной терапии этот подход был основным механизмом для переноса генов в клетки человека. Основная концепция вирусных векторов — использование врожденной способности вирусов доставлять генетический материал в инфицированную клетку. Применяемые в генной терапии вирусы модифицированы для ↑ безопасности, специфического поглощения и эффективности. Каждый конкретный вектор генной терапии на основе вируса обладает серьезными недостатками, которые следует сопоставить с потенциальным терапевтическим эффектом.
Например, в генной терапии ЗНО иммунный ответ на средство доставки, несущее противоопухолевый генетический материал, может быть успешно использован в качестве адъюванта.
При моногенных болезненных состояниях, наоборот, желательно, чтобы иммунная система игнорировала систему доставки гена, который должен экспрессироваться в течение продолжительного периода времени для замены или дополнения отсутствующего генного продукта.
Вирусные векторы получают из вирусов с геномами, состоящими либо из РНК (ретровирусы и лентивирусы), либо из ДНК [аденовирус, аденоассоциированный вирус, ВПГ и поксвирус (вакцинный вирус)]. Вирусные векторы входят в одну из двух основных категорий: интегрирующие векторы, которые вводят сами себя в геном реципиента, и неинтегрирующие векторы, которые часто (хотя и не всегда) образуют внехромосомный генетический элемент. Интегрирующие векторы, такие как γ-ретровирусные векторы и лентивирусные векторы, используются для трансфекции активно делящихся клеток, поскольку они наследуются стабильно. Но интеграция векторов несет риск инсерционного мутагенеза (опубликованы сведения о клинических онкогенных трансформациях при использовании ретровирусов).
Неинтегрирующие векторы, такие как аденовирусные векторы и векторы аденоассоциированного вируса, используют для трансфекции неактивных или медленно делящихся клеток, но они быстро (в случае аденовирусных векторов) выпадают из клеток, которые быстро делятся. Эффективная трансдукция генов может быть достигнута и применением векторов, которые сохраняются как эписомы, особенно в неделящихся клетках.
в) Заболевания, лечение которых проводится генной терапией:
1. Наследственный иммунодефицит. Гемопоэтические стволовые клетки — предпочтительная мишень для генной терапии ex vivo, потому что генетическая модификация самоподдерживающихся мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток гарантирует стабильное поступление в организм их потомков с откорректированными генами. Такие подходы обладают потенциалом для лечения состояний, которые проявляются, когда зрелые ростки кроветворения не развиваются или функционируют неправильно.
Процесс генной терапии на основе гемопоэтических стволовых клеток включает первоначальное выделение этих предшественников из костного мозга или периферической крови с использованием АТл, нацеленных на поверхностный маркер CD34, с последующей генетической модификацией данных клеток ex vivo с использованием векторов-переносчиков и кассеты экспрессии с корректирующим трансгеном.
Перед тем как вводить модифицированные клетки обратно пациенту, реципиента обычно лечат по схеме предтрансплантационной фармакотерапии, направленной на сокращение эндогенных клеток-предшественников для содействия приживлению клеток с откорректированными генами.
Первая убедительная клиническая польза доставки генов в целом и генной терапии на основе гемопоэтических стволовых клеток в частности была продемонстрирована на пациентах с наследственными иммунодефицитами. Эти первые исследования были нацелены на два типа синдромов тяжелого комбинированного иммунодефицита, оба из которых характеризуются дисрегуляцией развития лимфоцитов, а также на третье заболевание, Х-сцепленную хроническую гранулематозную болезнь. Дети, имеющие такие расстройства, страдают генерализованными инфекциями или задержкой в развитии.
Пациенты с тяжелым комбинированным иммунодефицитом из-за дефицита аденозиндезаминазы страдают от преждевременной смерти Т-клеток, В-клеток и натуральных киллеров в результате накопления пуриновых метаболитов. Пациентов с этим заболеванием лечили векторами, экспрессирующими ген аденозиндезаминазы. У первых пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом из-за дефицита аденозиндезаминазы было показано, что трансдуцированные Т-клетки, экспрессирующие трансгенную аденозиндезаминазу, сохраняются >10 лет; но терапевтический эффект генной терапии имел лишь частичную коррекцию метаболического дефекта.
В последнее время скорректированный протокол переноса генов CD34-положительных клеток костного мозга в сочетании с низкими дозами бусульфана обеспечил значительный уровень многолинейного стабильного приживления трансдуцированных предшественников, восстановление иммунной функции, коррекцию метаболического дефекта аденозиндезаминазы и доказанную клиническую пользу.
Х-сцепленный тип (группа Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит), при котором имеется недостаточность передачи сигнала цитокин-зависимой выживаемости в Т-клетках и натуральных киллерах, корректируется путем введения последовательности дикого типа общей цепи γ-С (компонент пяти цитокиновых рецепторов). Полное восстановление иммунной системы, избавление от инфекций и ↑ роста произошло у большинства прошедших лечение детей. В одном клиническом исследовании гематологические ЗНО развились у четырех пациентов. Однако среди >20 пациентов, которых лечили в двух отдельных клинических исследованиях, у пяти развилось острое лейкозоподобное заболевание, приведшее к одной смерти.
Двое взрослых пациентов с Х-сцепленной хронической гранулематозной болезнью, перенесших рецидивирующие бактериальные инфекции, получили лечение CD34-положительными клетками, трансдуцированными с помощью gp91 phox, со значительным клиническим улучшением в краткосрочной перспективе. Но у обоих этих пациентов наблюдалось ↑ количества трансдуцированных генами клеток, вызванное транскрипционной активацией способствующих росту генов, → миелодисплазии и постепенной потере эффективности.
Несмотря на убедительное клиническое улучшение, наблюдаемое у большинства пациентов, получавших генную терапию иммунодефицита ЛП первого поколения на основе гемопоэтических стволовых клеток, прогресс в этой области на многие годы остановил тяжелые и даже опасные для жизни неблагоприятные последствия, возникающие в результате случайной интеграции ретровирусов. Недавняя разработка векторов (таких как лентивирусные векторы) с повышенной эффективностью и безопасностью в доклинических моделях возродила интерес к этому подходу.
В результате генная терапия гемопоэтическими стволовыми клетками, включающая эти новые векторы, была успешно протестирована при тяжелых наследственных заболеваниях иммунной системы (синдром Вискотта-Олдрича и Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит) и крови (β-талассемия) и нейродегенеративных болезнях накопления (адренолейкодистрофия и метахроматическая лейкодистрофия).
2. Потеря зрения. Исключительную пользу, которую дает замена гена пациентам с тяжелыми дегенеративными заболеваниями, впервые выявило проведение генной терапии при заболеваниях сетчатки. Ученые-клиницисты использовали терапию введения нормальной последовательности гена в составе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, экспрессирующего трансген RPEG5 с использованием прямой субретинальной инъекции у взрослых и детей с врожденным амаврозом Leber. Это редкое наследственное заболевание глаз разрушает фоторецепторы. Результат генной терапии — сохранение зрения, несмотря на дальнейшую дегенерацию сетчатки.
3. Печень. Печень представляет собой привлекательную мишень для прямой генной терапии in vivo, поскольку гепатоциты — надежные белковые фабрики, высвобождающие свои продукты в кровоток. Генная терапия печени обеспечивает стратегию лечения нескольких наследственных метаболических заболеваний, а также дефицита белков плазмы, наблюдаемого при различных коагулопатиях. Поскольку для эффективного лечения может быть достаточно ↑ уровня циркулирующего фактора свертывания крови с <1% (у болеющих пациентов) до ≥5%, направленная на печень генная терапия протестирована для лечения тяжелой гемофилии В.
В исследованиях с использованием векторов аденоассоциированного вируса-8 (со специфическим тропизмом к гепатоцитам) для доставки трансгена фактора VIII или IX в сочетании с временной иммуносупрессией (ГКС) наблюдались стабильные долгосрочные достаточные уровни фактора в крови (6%), приводящие к значительному улучшению.
4. Сердечно-сосудистые и легочные заболевания. Применение генной терапии при заболеваниях ССС сфокусировано на достижении терапевтического ангиогенеза для пациентов, страдающих хронической ИБС или критической ишемией конечностей, а также на улучшении сердечной функции у пациентов с СН. Использование генов для реваскуляризации ишемического миокарда при ИБС и критической ишемии конечностей при заболевании периферических артерий в центре внимания двух десятилетий доклинических исследований с различными ангиогенными медиаторами, включая VEGF, фактор роста фибробластов, фактор роста гепатоцитов и другие, кодируемые ДНК в составе плазмид или аденовирусных векторов.
В общей сложности исследования подобной генной терапии на экспериментальных животных моделях ишемии обнадеживающие и в конечном итоге перешли к клиническим исследованиям. Несмотря на официальное доказательство концепции и обоснованную безопасность, результаты последних клинических исследований терапевтического ангиогенеза при ишемии миокарда и критической ишемии конечностей дали противоречивые результаты, а способы индукции клинически эффективного терапевтического ангиогенеза остаются сложно достижимыми.
Эти противоречивые результаты могут быть вызваны рядом причин: применения одного фактора роста недостаточно для решения разноплановой задачи по разработке эффективной индукции коллатеральных сосудов, потребность в более продолжительной доставке фактора роста для обеспечения более стабильных сосудов и нацеливание на артериогенез, а не на ангиогенез для достижения ↑ перфузии.
Таким образом, в настоящее время для лечения подобных ишемических состояний усилия направлены в сторону использования различных стратегий по использованию клеточной терапии, применения комбинированных стратегий доставки клеток и генов с целью достижения лучшего терапевтического эффекта. Например, использование комбинированной доставки эндотелиальных и гладкомышечных клеток (каждый тип клеток модифицирован, чтобы секретировать свойственный им ангиогенный фактор роста) для пациентов с критической ишемией конечностей.
В отношении СН исследования по применению генной терапии сосредоточены на восстановлении нарушения обмена кальция, характерного для недостаточности кардиомиоцитов человека Поскольку было обнаружено, что ↓ уровней кальциевой АТФ саркоплазматического ретикулума, кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума, при СН — ключевой фактор в изменении внутриклеточного обмена ионов кальция, этот белок стал клинической мишенью при выборе генов для доставки. Сверхэкспрессия саркоплазматического ретикулума путем доставки данного гена в кардиомиоциты → восстановлению нарушенных трансмембранных токов кальция → улучшению сердечной сократимости, ↓ частоты аритмий и нормализации использования кислорода в животных моделях с СН.
В рамках исследования Нью-Йоркской ассоциации сердца в фазах I-II исследования продемонстрированы клинические преимущества доставки аденоассоциированного вируса трансгена саркоплазматического ретикулума через коронарный кровоток. К сожалению, в более крупном проспективном исследовании 2 отдаленных результатов Нью-Йоркской ассоциации сердца не удалось продемонстрировать аналогичные клинические преимущества вследствие неэффективной экспрессии трансгена в миокарде. Это подчеркивает важность решения задачи по обеспечению эффективности доставки генов к сердечной ткани.
- Муковисцидоз. Экспериментальные протоколы генной терапии муковисцидоза реализуются с 1990 г. При муковисцидозе мутации обнаруживаются в гене трансмембранного регулятора проводимости. Трансдукция эпителия носа и бронхов выполнима посредством подходов, включающих несистемную доставку. Разработанные методы невирусной генной терапии доставляют копию гена трансмембранного регулятора проводимости в ДП пациентов с муковисцидозом. Несколько плацебо-контролируемых клинических исследований липосом-опосредованного переноса гена трансмембранного регулятора проводимости в носовой эпителий подтвердили его безопасность и продемонстрировали различные степени функциональной коррекции.
Для генной терапии муковисцидоза в нескольких клинических исследованиях оценивался потенциал ретровекторов, аденовекторов и векторов аденоассоциированного вируса. При использовании как невирусных, так и вирусных систем доставки наблюдались легкие побочные эффекты. Долгосрочная клиническая польза была незначительной. В настоящее время в доклинических исследованиях используются векторы с модифицированной структурой.
5. Злокачественные новообразования. Одна из наиболее впечатляющих возможностей по использованию генной терапии — применение в онкологии. Стратегии генной терапии сгруппированы исходя из механизма их действия. Они включают генную терапию, направленную на прямую индукцию цитотоксических эффектов в раковых клетках (путем доставки онколитических вирусов или доставки индукторов апоптоза или генов «самоубийства»), генную терапию, направленную на активацию иммунного ответа на раковый АНг, и генную терапию, направленную на микроокружение опухоли.
- Прямые цитотоксические эффекты. Онколитические вирусы — терапевтически полезные противораковые вирусы, которые избирательно инфицируют, усиливают, а затем повреждают ткани ЗНО, не причиняя вреда нормальным тканям. Селективность различных онколитических вирусов в отношении ЗНО построена на слабых местах, обнаруживаемых во многих типах ЗНО, таких как отсутствие противовирусных реакций, активация путей Ras, гибель опухолевых супрессоров и нарушенный апоптоз. Онколитические вирусы убивают инфицированные клетки ЗНО множеством различных способов, начиная с прямой опосредованной вирусом цитотоксичности и заканчивая различными механизмами цитотоксических иммунных эффекторов.
Помимо прямого вирусного цитопатического эффекта, вирусные векторы используют для доставки генов к клеткам ЗНО → к гибели таких клеток. Соответствующие трансгены кодируют клеточные белки, которые участвуют в апоптозе или предотвращают пролиферацию. Селективность активации таких генов только в опухолевых клетках достигается либо за счет использования вышеупомянутых онколитических вирусов, либо за счет экспрессии трансгенов под контролем промоторов, которые активируются только в клетках ЗНО (например, теломераза человека или сурвивин) или при определенных типах ЗНО (пробазин при ЗНО простаты, церулоплазмин при ЗНО яичников, HER2 при ЗНО МЖ и карциноэмбриональный АГн при ЗНО толстой кишки).
Наиболее клинически прогрессивным ЛС генной терапии ЗНО является дефектный по репликации аденовектор, экспрессирующий ген р53 человека. Эта терапия (гендицин) одобрена в Китае для лечения пациентов с плоскоклеточным ЗНО головы и шеи путем прямого введения в ложе опухоли.
Еще один интересный метод — использование «суицидных» генов. «Суицидная» генная терапия включает доставку пролекарственного активирующего фермента («суицидного» гена), превращающего нетоксичные пролекарства в цитотоксические метаболиты. Прототип такой комбинации «суицидного» гена/пролекарство — тимидиновая киназа герпесвирусов/ганцикловир. Ген тимидиновой киназы селективно экспрессируется только в клетках ЗНО (одним из методов, описанных выше), при применении ганцикловира преобразуется в цитотоксический агент, фосфорилированный ганцикловир.
Фосфорилированный ганцикловир токсичен только для делящихся клеток, что еще больше ↑ селективность по отношению к клеткам ЗНО. Первоначально эта стратегия изучалась при агрессивных ЗНО ГМ (мультиформная глиобластома), а относительно недавно — при локально рецидивирующих опухолях предстательной железы, МЖ и толстой кишки. Среди других цитотоксических стратегий — экспрессия секретируемых проапоптотических белков, таких как индуцирующий апоптоз лиганд, связанный с ФНО, или цитотоксины, такие как экзотоксин синегнойной палочки.
- Иммуномодулирующая клеточная терапия. После многолетних экспериментальных и клинических исследований иммунотерапевтические подходы наряду с хирургией, лучевой терапией, XT и видами терапии, направленными на путь факторов роста, лежат в основе лечения ЗНО. Два иммунотерапевтических подхода включают использование моноклональных АТл для преодоления ингибиторов иммунных контрольных точек, таких как цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный АГн-4, и белок-1 запрограммированной смерти клетки на цитотоксических Т-клетках или форму адаптивного переноса клеток, в которой использовалась генная инженерия ex vivo Т-клеток больного ЗНО, чтобы экспрессировать химерные АГн-рецепторные клетки, создавая специфичные для пациента химерные АГн-рецепторные Т-клетки (рис. 2).
Рисунок 2. Терапия злокачественного новообразования химерными антигенными (АГн)-рецепторными Т-клетками. Химерные АГн-рецепторные Т-клетки генетически модифицированы ex vivo путем создания химерных рецепторов АГн на поверхности Т-клеток. Затем они размножаются в лаборатории и повторно вводятся пациенту.
Противоопухолевая терапия химерными АГн-рецепторными Т-клетками рассматривается как форма комбинированной генной и клеточной терапии, которая в корне меняет лечение ЗНО. Терапия химерными АГн-рецепторными Т-клетками требует взятия крови у пациента, отделения Т-клеток, генетической модификации Т-клеток ex vivo для экспрессии химерных АГн-рецепторов на поверхности, а затем их размножения in vitro. Химерные АГн-рецепторы — синтетические молекулы, которые позволяют модифицированным Т-клеткам распознавать на клетках ЗНО определенный белок или АГн и прикрепляться к нему.
Пациенту со сниженным иммунитетом после XT вводятся химерные АГн-рецепторные Т-клетки. Зараженные химерные АГн-рецепторные Т-клетки размножаются у пациента, нацеливаются, атакуют и убивают клетки, экспрессирующие поверхностный АГн, соответствующий генно-модифицированному химерному АГн-рецептору. Этот процесс вызывает обширный массивный отклик высвобождения цитокинов, являющийся нежелательным побочным эффектом, клиническое управление которым с применением ГКС и анти-IL-6 терапии наряду с лечением других побочных эффектов (например, ОГМ) — непременное условие общей эффективности этого нового подхода противоопухолевой терапии.
Терапия с помощью химерных АГн-рецепторных Т-клеток проработана и одобрена для клинического использования, нацелена на поверхностный АГн CD19 В-клеток, эффективна при В-клеточных ЗНО, включая острый лимфоцитарный лейкоз у детей и В-крупноклеточные лимфомы, встречающиеся у молодых людей. У прошедших лечение пациентов наблюдается аплазия В-клеток (CD19 также экспрессируется на нормальных В-клетках), с целью профилактики инфекций проводится восполнение дефицита Ig. Необыкновенный успех терапии химерными АГн-рецепторными Т-клетками в достижении стойких ремиссий, даже в случаях рецидива или неблагоприятного прогноза острого лимфоцитарного лейкоза и В-крупноклеточных лимфом, подстегивает развитие химерных АГн-рецепторных Т-клеток, нацеленных на различные ЗНО.
Например, АГн CD22 и CD123 при лейкозах и белок ВСМА при миеломе. Предстоит выяснить, позволит ли специфичность и доступность таких АГн в солидных опухолях применять данный подход и будет ли лечение эффективным. Ранние исследования привели к созданию химерных АГн-рецепторных Т-клеток, нацеленных на EGFRvIII, у пациентов с глиобластомой и мезотелином, который относительно сверхэкспрессируется при панкреатическом и немелкоклеточном ЗНО легкого. На сегодняшний день количество зарегистрированных клинических исследований терапии химерными АГн-рецепторными Т-клетками приближается к 200.
Предполагаемый следующий этап развития — создание «стандартных» химерных АГн-рецепторных Т-клеток, готовых к использованию у любого пациента с ЗНО, экспрессирующим известную важную мишень, что позволит обойти несколько трудоемкую, технически сложную и дорогостоящую процедуру извлечения, отделения, генетической модифиции и повторного введения пациенту его собственных клеток.
- Разрушение микросреды злокачественных новообразований. Нацеливание на микросреду ЗНО — еще один важный подход генной терапии ЗНО, поскольку он состоит из нормальных клеток, которые не должны развивать устойчивость к терапии. Наиболее очевидная мишень — процесс неоваскуляризации ЗНО. Использование антиангиогенных ЛП, таких как бевацизумаб (Авастин) — моноклональное анти-VEGF АТл, показало положительные результаты клинических исследований для некоторых типов клеток ЗНО, но эффект может быть временным или незначительным для других.
Процесс ангиогенеза сложен, ингибирования только одного аспекта может быть недостаточно. Аналогичная стратегия включает использование микроРНК для снижения экспрессии рецепторов VEGF или VEGF. Ряд антиангиогенных факторов (ангиостатин и эндостатин) экспрессирован в вирусных векторах и использовался в доклинических исследованиях, но еще не дошел до клинических.
6. Другие виды молекулярной терапии: РНК-интерференция и редактирование генома:
- РНК-интерференция. РНК-интерференция регулирует экспрессию генов с помощью высокоточного механизма последовательного подавления генов на стадии трансляции путем ↓ определенных информационных РНК или путем блокирования их трансляции в белок. Исследования по использованию РНК-интерференции в терапевтических целях представляют значительный интерес.
Было высказано предположение, что многие из заболеваний, связанных с мишенями, поддаются традиционной блокаде низкомолекулярными ЛС и потенциально их экспрессия может быть подавлена с помощью РНК-интерференции. В последние годы концепция РНК-интерференции активно внедряется в терапевтическую практику, в настоящее время проводятся многочисленные испытания.
РНК-интерференция использовалась для подавления функции генов, причастных к ЗНО, при возрастной макулярной дистрофии и транстиретиновом амилоидозе → терапевтическому эффекту в клинических исследованиях. Результатом исследования стало одобрение FDA первой в истории терапии с использованием РНК-интерференции для клинического использования.
Эта терапия (патисиран) одобрена для лечения заболевания периферической НС (полинейропатии), вызванного наследственным транстиретиновым амилоидозом. Клинические испытания показали эффективность SiPHK-опосредованного ↓ экспрессии гена PCSK9 как метода ↓ уровней ЛПНП.
- Редактирование генома. Направление развития генной терапии может быть смещено от введения терапевтического гена к применению стратегий генной терапии по редактированию генома, при которой с помощью программируемых нуклеаз патогенная мутация корректируется в ее естественном местоположении в геноме. К таким программируемым нуклеазам относятся нуклеазы «цинкового пальца», эффекторные нуклеазы, нуклеазы эффектора, схожие с факторами транскрипции, и недавно описанная нуклеаза Cas9, связанная с короткими палиндромными повторами.
Изложенные выше методики редактирования генома используются не только для коррекции мутации, но также для инактивации вредных мутаций в больных клетках, для введения защитных мутаций, для добавления терапевтических трансгенов и для разрушения вирусной ДНК. Такие виды лечения редактированием генома уже включены в расширенные доклинические и клинические исследования для ряда показаний.
- Механизмы редактирования генома и клиническое применение. Программируемые нуклеазы действуют как высокоспецифичные «молекулярные ножницы», модифицированные для нацеливания на конкретную последовательность в геноме и введения двухцепочечного разрыва в ДНК проксимально по отношению к намеченному месту (рис. 3).
Рисунок 3. Концептуальные модификации терапевтического редактирования генома. Конкретный тип терапевтической стратегии редактирования генома зависит от характера мутации или заболевания. А. Разрушение гена с помощью негомологичного соединения концов: для разрушения гена экспрессия патологического белка подавляется путем введения в желаемый локус гена двухцепочечного разрыва. Неэффективный эндогенный механизм репарации посредством негомологичного соединения концов → образованию инсерции или делеции нескольких нуклеотидов в целевом гене → мутациям сдвига рамки считывания, создающей преждевременные стоп-кодоны и нефункциональный белковый продукт (усеченный белок) или опосредованный распад транскриптов (отсутствие белка). В. Коррекция гена посредством негомологичного соединения концов: два двухцепочечных разрыва, нацеленные на обе стороны патогенетической экспансии или инсерции, можно устранить с помощью негомологичного соединения концов, вызывая делецию промежуточных последовательностей и тем самым запуская терапию. C. Коррекция гена направляемой гомологией репарацией: для коррекции мутаций используется механизм коррекции гена репарацией, направляемой гомологией. Рядом с местом мутации индуцируется двухцепочечный разрыв. Репарация места разрыва посредством направляемой гомологией репарацией достигается с помощью экзогенной матрицы, исправляющей к месту мутации и восстанавливающей нормальную функцию гена. D. Редактирование генома: в этом методе терапевтический трансген вводится либо в нативный, либо в ненативный локус (участок «безопасной гавани») генома. В необходимом локусе индуцируется двухцепочечный разрыв, в ядро вводится матрица направляемой гемологии, содержащая соответствующий трансген и ассоциированные элементы контроля транскрипции
Главный путь репарации клеточной ДНК для восстановления двухцепочечного разрыва — негомологичное соединение концов, соединяющее два конца двухцепочечного разрыва путем прямого лигирования, при этом соединенные концы негомологичны или имеют низкую степень гомологии. В результате негомологичное соединение концов ассоциируется с высокой вероятностью ошибки, приводящей к инсерции или делеции нескольких нуклеотидов в месте разрыва.
Таким образом, полученные в результате инсерции-делеции мутации используются для селективной инактивации генов (см. рис. 3). Специфическими мишенями для такого подхода могут быть доминантно-негативные генетические нарушения, при которых генный продукт мутантного аллеля действует как «токсичный белок» и мешает функционированию здорового белкового продукта аллеля дикого типа. Использование механизма негомологичного соединения концов для специфической инактивации мутантного гена, не затрагивая копию дикого типа, значительно улучшит фенотипы таких нарушений.
Аналогично рассматривают и защиту от инфекционных или генетических заболеваний за счет инактивации усиливающих патологические процессы генов дикого типа. К ним относятся, например, индуцирование мутаций потери функции через негомологичное соединение концов к Т-клеточному рецептору CCR5 для лечения ВИЧ или в гене PCSK9 для лечения гиперхолестеринемии. Первое одобренное клиническое исследование по редактированию генома включало использование нуклеаз «цинкового пальца» для нацеливания на локус CCR5 в Т-клетках аутологичных CD4+ ex vivo с помощью аденовирусных векторов для лечения ВИЧ-инфекции.
Клиническое наблюдение показало, что введение пациентам Т-клеток с отредактированными генами хорошо переносится ими, CCR5-тропные клетки защищены от заражения CCR5-тропным вариантом ВИЧ. Однако общая частота CCR5-тропных клеток, а также абсолютное количество перенесенных Т-клеток были слишком низкими, чтобы иметь длительный терапевтический эффект. В ряде исследований в настоящее время проверяется способность улучшить клиническую эффективность этого подхода за счет ↑ приживления отредактированных клеток (посредством немиелоаблативной лимфодеплеции), нацеливания на аутологичные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (нацеливание на различные подмножества клеток, чувствительных к ВИЧ, включая макрофаги), путем тестирования разных векторов и перехода к технологии активатора транскрипции.
Программируемые нуклеазы использовать для нацеливания на чужеродную ДНК, такие как вирусные геномы, инактивируя специфичные для вируса гены, не затрагивая специфичную для человека ДНК хозяина. Такой подход уже прошел клинические испытания, применялся в отношении ВПЧ. Наконец, нацеливание двух нуклеаз для образования двух двухцепочечных разрывов вокруг патогенной инсерции (см. рис. 3) может быть полезно для лечения нарушений эскпансии нуклеотидных повторов при спиноцеребеллярной атаксии и болезни Хантингтона.
Альтернативный механизм устранения расщепления ДНК — репарация, направляемая гомологией, между эндогенной ДНК и экзогенно введенным донорским фрагментом, содержащим нормальную нуклеотидную последовательность (см. рис. 3). Таким способом патогенная мутация окончательно корректируется обратно в состояние нормальной последовательности. Этот подход коррекции мутаций сохраняет архитектуру генома и генный контроль в рамках нормальных клеточных регуляторных элементов и применяется при широком спектре генетических нарушений.
На сегодняшний день методы редактирования генов использовались только в доклинических исследованиях для прямой коррекции вызывающих болезнь мутаций, ассоциированных с Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом, гемофилией В, СКА и дефицитом α1-антитрипсина, а также для репарации мутаций, ассоциированных с болезнью Паркинсона (ген SNCA), в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека, получаемых от пациентов, или в моделях доклинических исследований на мышах.
Специфические для органов нуклеазы придают уникальную ценность традиционному подходу добавления генов, делая возможными инсерции терапевтических трансгенов (рис. 3) в определенных местоположениях «безопасной гавани» в геноме человека, обеспечивая длительную экспрессию трансгена, более эффективный контроль над количеством копий трансгена и уровнями экспрессии, ↓ вероятности случайного инсерционного мутагенеза. Инсерция гена используется для секреции определенных факторов или для оптимального изменения фенотипа генетически модифицированной клетки.
Вышеупомянутые стратегии модификаций генов применяют путем прямого подхода in vivo для модификации существующих клеток или альтернативно, сначала модифицируя клетки ex vivo с последующей трансплантацией генетически модифицированных клеток in vivo (рис. 4), аналогично изложенной выше реализации для химерных АГн-рецепторных Т-клеток. Первый метод коррекции генов in vivo уже дошел до этапа клинических исследований при лечении гемофилии В. Подход основан на совместной доставке нуклеаз «цинкового пальца» с векторами аденоассоциированного вируса, кодирующими фактор IX, для нацеливания на интеграцию корректирующего комплементарного фактора IX ДНК в кодирующий альбумин локус генома в клетках печени.
Рисунок 4. Сравнение ex vivo и in vivo лечебных стратегий геномной терапии. При ex vivo терапии клетки, полученные от пациента, подвергаются редактированию генома, их размножают и затем подсаживают обратно пациенту для повторного заселения больного органа или тканей здоровыми клетками. Наиболее перспективные кандидаты — гемопоэтические стволовые клетки, которые затем повторно вводят путем трансплантации костного мозга. Альтернативный вариант: специфичные для пациента индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные от больного пациента, генетически модифицировать, стимулировать дифференцироваться в желаемый клеточный росток (клетки сердца, нервные клетки, клетки печени и т. д.), а затем трансплантировать обратно тем же пациентам. Терапия in vivo включает редактирование генома клеток in situ. Доставка может быть системной или локализованной, предпочтительные органы-кандидаты — печень, мышцы, головной мозг и глаза. Для эмбриональной коррекции полученный во время экстракорпорального оплодотворения эмбрион на ранней стадии развития проходит редактирование генома, скорректированную бластоцисту возвращают в утробу матери
Ожидается, что в ближайшее время аналогичные подходы для пациентов с гемофилией А и пациентов с лизосомными болезнями накопления будут включены в клинические исследования.
Приоритетной клеткой-мишенью последнего подхода ex vivo могут быть стволовые клетки взрослых. Их берут у больного пациента, генетически модифицируют ex vivo, размножают и затем подсаживают пациенту для повторного заселения больного органа или тканей здоровыми клетки. Многолетний клинический опыт в области выделения, выращивания, генетической модификации и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток сделал заболевания, поражающие кровеносную систему, перспективными мишенями для стратегий, основанных на редактировании генома ex vivo. Возможные болезни-мишени: тяжелый комбинированный иммунодефицит, анемия Фанкони, синдром Вискотта-Олдрича и СКА.
Задача этих подходов заключается в достижении эффективных, надежных и специфических генных модификаций гемопоэтических стволовых клеток ex vivo, потому что в отличие от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, например, они не подвергаются эффективной клональной экспансии. Первые клинические испытания с участием нуклеазы Cas9, связанной с короткими палиндромными повторами, в Китае и США направлены на аналогичные цели, и оба связаны с разрушением белка 1 запрограммированной смерти клетки или генов, кодирующих Т-клеточный рецептор в химерных АГн-рецепторных Т-клетках, для создания более эффективных видов иммунотерапии ЗНО и последующего лечения множественной миеломы, ЗНО ПЖЖ и легких или глиобластомы.
Исследователи рассматривают и третий подход внесения постоянных изменений в геномы человеческих эмбрионов. С медицинской точки зрения его преимущество заключается в том, что генная коррекция будет постоянной; ни лицо, прошедшее лечение, ни кто-либо из его или ее потомков не будет иметь аллель заболевания. В принципе, процедура предполагает манипуляции с эмбрионами на очень ранней стадии одновременно с ЭКО (рис. 4).
В Китае недавно опубликовали статьи, описывающие первые шаги в создании таких модификаций у жизнеспособных и нежизнеспособных эмбрионов. Среди выявленных в этих исследованиях недостатков — вероятность побочных модификаций, вызванных нуклеазой Cas9, связанной с короткими палиндромными повторами (в клетках были обнаружены нежелательные изменения за пределами целевого гена), а также вероятность мозаицизма (при котором эмбрион содержал смесь отредактированных и неизмененных клеток). В недавнем исследовании ученым из США удалось технически усовершенствовать этот процесс, и они смогли исправить генетическую мутацию в гене MYBPC3 (отвечающем за ГКМП) в жизнеспособных доимплантационных человеческих эмбрионах с отсутствием каких-либо свидетельств побочной модификации или мозаицизма.
Цель всех этих исследований и других программ, которые только готовятся к запуску, не создание беременности (эмбрионы никогда не имплантировались), а лишь демонстрация возможности подобного подхода при лечении заболеваний.
г) Контрольные вопросы:
1. Примером чего из нижеперечисленного является восстановление мениска путем конструирования имплантируемого каркаса, засеянного мезенхимальными стволовыми клетками, которые дифференцируются в хондроциты?
A. Генная терапия ex vivo.
B. Имплантация аутологичной ткани мениска.
C. Тканевая инженерия.
D. Прямое перепрограммирование стволовых клеток.
E. Соматическая генная терапия.
Ответ С. Вместо простого введения клеток в пораженную область в тканевой инженерии клетки перед трансплантацией подсаживаются или засеваются на трехмерные каркасы (полученные из различных биоматериалов). Они включают либо клеточные каркасы, которые ex vivo засеваются клетками перед их трансплантацией in vivo, либо бесклеточные каркасы, которые требуют повторного заселения каркаса клетками реципиента с целью его восстановления после трансплантации. На сегодняшний день эти усилия в основном сосредоточены на опорно-двигательном аппарате, как представлено в примере. Ex vivo и терапия соматическими генами, по сути, включают перенос определенного генетического материала в клетки для коррекции или восстановления клеточного дефекта.
Прямое программирование стволовых клеток — прямое преобразование фенотипа одного типа клеток (например, фибробластов) в другой (например, хондроциты). Имплантация аутологичной ткани мениска не требует какой-либо клеточной и генной терапии.
2. На сегодняшний день у пациентов с каким заболеванием из нижеперечисленных применялась терапия фетальными клетками?
A. Болезнь Паркинсона.
B. ИМ.
C. СН.
D. Переливание ЛП крови.
E. Восстановление хряща.
Ответ А. Клетки фетального происхождения демонстрируют повышенную пролиферативную способность и повышенную способность дифференцироваться в зрелые или специализированные клетки. Несмотря на то что эта форма клеточной терапии представляет собой форму регенеративной медицины с большим потенциалом, единственными клетками фетального происхождения, которые до настоящего времени использовались в клинических областях применения, являются дофаминергические клетки, полученные из развивающейся НС плода, для лечения болезни Паркинсона (см. Приживление тканей плода).
3. Что из нижеперечисленного не является формой генной терапии?
A. Трансфекция.
B. Трансдукция.
C. РНК-интерференция.
D. Редактирование генома.
E. Электропорация ДНК.
Ответ Е. Электропорация — метод исследования в клеточной биологии сугубо in vitro, обеспечивает электропроницаемость клеточных мембран с помощью внешнего электрического поля для введения в клетку фрагмента ДНК (или других агентов). Все остальные варианты — методы генной терапии. Трансфекция — прямая доставка голой ДНК путем инъекции, использования липосом, наночастиц и других средств. Трансдукция — генная терапия, опосредованная вирусными векторами. РНК-интерференция — высокоточный механизм регуляции экспрессии гена с помощью сайленсинга, определяемого последовательностью (путем уничтожения конкретных информационных РНК или блокирования их трансляции в белок).
Редактирование генома — способ исправления патогенной мутации в ее естественном месте расположения в гене (в отличие от более распространенного метода генной терапии восстановления гена, при котором в геном вставляется целый ген).
