Токи через потенциалзависимые мембранные каналы. Локальная фиксация потенциала мембраны.
До сих пор мы рассматривали токи и сдвиги проводимости всей мембраны при ее деполяризации. Несколько лет назад был разработан метод регистрации токов в микроучастках мембраны диаметром примерно 1 мкм, который позволяет идентифицировать молекулярные реакции одиночных каналов на основе зависимостей ионных токов от потенциала и времени. Рис. 2.11 иллюстрирует принцип локальной фиксации потенциала ("patch clamp") [12, 24]. Стеклянная микропипетка, диаметр кончика которой меньше 1 мкм, подводится к клетке вплоть до контакта с мембраной, и когда через пипетку подается отрицательное давление, пипетка обычно закупоривается участком мембраны; электрическое сопротивление между пипеткой и внеклеточным раствором возрастает скачком более чем до 1 ГОм (109 Ом). В результате микроучасток мембраны электрически изолируется от остальной мембраны. Канал пипетки соединен с усилителем обратной связи, который обеспечивает регулирующую цепь для поддержания потенциала пипетки на заданном уровне. Ток, необходимый для стабилизации потенциала-«ток фиксации»-точно соответствует току, протекающему в каждый момент через микроучасток мембраны. Командный потенциал усилителя можно устанавливать произвольно, так что регистрация токов через микроучасток мембраны может осуществляться при различных мембранных потенциалах или после ступенчатых сдвигов потенциала.
Рис. 2.11. Схема локальной фиксации мембранного потенциала («пэтч-кламп»). Изображен продольный срез через регистрирующую микропипетку (обозначена черным цветом) с диаметром контактирующего с мембраной кончика ~1 мкм. Если кончик электрода абсолютно чист и поверхность клетки освобождена от волокон соединительной ткани, то при подаче через пипетку отрицательного давления образуется тесный контакт, который создает электрическую изоляцию каналов находящегося в кончике пипетки микроучастка мембраны от остальной мембраны клетки (вставка). Таким способом можно регистрировать токи каналов с помощью усилителя обратной связи, соединенного с раствором электролита в пипетке (по [12, 24] с изменениями)
Гигаомный контакт между пипеткой и мембраной настолько прочен, что после отведения пипетки микроучасток мембраны часто отрывается от клетки, оставаясь прикрепленным к кончику пипетки. В этом случае регистрацию можно производить в микроучастке мембраны, отделенном от клетки, причем цитоплазматическая поверхность этого участка может омываться любым нужным раствором. Путем искусных манипуляций микроучасток мембраны можно даже перевернуть на пипетке наружной стороной мембраны наружу. Тогда цитоплазматическую поверхность можно орошать раствором в пипетке, который должен примерно соответствовать внутриклеточной среде, а на наружную поверхность могут воздействовать растворы различного состава; такая конфигурация «наружной стороной наружу» („outside-out") очень полезна для тестирования реакций каналов мембраны на изменения состава внеклеточной среды, на медиаторы или на фармакологические средства внеклеточного действия. Достаточно прочный контакт между участком мембраны и кончиком пипетки может быть достигнут только при абсолютной чистоте стекла пипетки и мембраны. Образованию контакта могут мешать волокна соединительной ткани, которые обычно приходится удалять путем обработки мембраны такими ферментами, как коллагеназа [12].
