Как указывалось выше, для осуществления ПЦР необходимо точно знать структуру кодирующих участков изучаемого гена и примыкающих к ним иитронных областей (без чего невозможен синтез праймеров, инициирующих реакцию). Некоторые участки гена (например, сверхдлинные области тандемных тринуклеотидных или более сложных повторов) не могут быть эффективно амплифицированы в ПЦР. Кроме того, ПЦР-опосредованная прямая ДНК-диагностика не всегда легко применима для анализа больших и сложных по своей молекулярной организации генов (таких как ген дистрофина), выявления протяженных делеций в гетерозиготном состоянии и в некоторых других случаях.

Поэтому при ряде наследственных заболеваний используется другой метод детекции изменений нуклеотидного состава гена - блот-гибридизация. Геномная ДНК обрабатывается одной из рестрикционных эндонуклеаз, после чего образующийся набop большого числа рестрикционных фрагментов ДНK различной длины фракционируется в агарозпом геле с разделением их по молекулярной массе. Далее, после денатурации ДНК, проводится процедура блоттинга -переноса фрагментов ДПК с геля на нитроцеллюлозиый или нейлоновый фильтр (это осуществляется за счет действия осмотических сил, вакуума или электрического поля), в результате чего на фильтре фиксируется точная реплика ДИК-рестрикта.

Денатурированные фрагменты ДНК гибридизуются с радиоактивно-меченым зондом - молекулой ДНК длиной несколько сотен нуклеотидов. После отмывки фильтра и авторадиографии на рентеновской пленке можно видеть точное положение и оценить длину фрагментов ДНК, комплементарных использованному зонду. Таким образом, блот-гибридизация позволяет идентифицировать специфические последовательности нуклеотидов в общем наборе рестрикционных фрагментов геномной ДНК.

Представленная технология блот-гибридизации ДНК носит название блот-гибридизации по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) - по имени английского исследователя, предложившего данный метод в 1975 г. Аналогичным образом может проводиться гибридизация ДНК-зонда с электрофоретически разделенными молекулами РНК с целью идентификации специфических последовательностей тканевых РНК (Нозерн-блоттинг), а также гибридизация меченых антител со специфическими белками (Вестерн-блоттинг, или иммуноблоттинг).

Модификациями Саузерн-блоттинга являются методы гибридизации с ДНК-зондом молекул ДНК (РНК), нанесенных на фильтр без предварительной рестрикции и электрофореза - дот-гибридизация (при нанесении на фильтр округлого пятна ДНК) и слот-гибридизация (при вытянутой форме пятна).

Метод блот-гибридизации обладает высокой чувствительностью, однако он весьма трудоемок, предполагает использование радиоактивных зондов, предъявляет высокие требовапия к качеству анализируемой ДНK и требует для проведения больших количеств геномной ДНК (5-10 микрограмм, что на несколько порядков превышает количество ДНК, необходимое для проведения ПЦР). Тем не менее во многих случаях он играет ведущую роль в прямой ДНК-диагностике, в том числе в сочетании с другими разнообразными вышеописанными методами исследования структуры ДНК. Например, когда та или иная точковая мутация затрагивает сайт узнавания используемой при блот-гибридизации рестриктазы, на пленке можно четко зафиксировать отсутствие соответствующей полосы или появление атипичного фрагмента ДНК.

Удлинение определенного участка изучаемого гена (например, при болезнях экспансии повторов) или делеция участка гена также приведут к изменению размера одного из фрагментов ДИК и появлению атипичной полосы либо отсутствию полосы на радиоавтографе.

- Также рекомендуем "Количественная ПЦР диагностика. ДНК-биочип"