Поскольку точковые мутации могут иметь самую различную локализацию, для их обнаружения необходимо проводить тотальное исследование всей кодирующей области гена. Принимая во внимание тот факт, что гены многих заболеваний содержат в своем составе десятки экзонов, полное секвенирование кодирующей области может представлять исключительно трудоемкую задачу. Для облегчения идентификации мутаций были предложены различные скрининговые методы анализа, позволяющие предварительно отбирать предположительно мутантные фрагменты ДНК, подлежащие секвенированию.
Наиболее распространенным является анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, или SSCP-анализ (от англ. «Single Strand Conformation Polymorphism») [Orita M. et al., 1989].
При проведении SSCP-анализа амплифицированные в ПЦР фрагменты ДНК исследуются в особых неденатурирующих условиях, при которых однонитевые молекулы ДНК сохраняют свою пространственную организацию в процессе электрофореза. Замена даже одного нуклеотида приводит к изменению конформации исследуемых полинуклеотидных цепей, в результате чего нарушается их электрофоретическая подвижность (что может быть выявлено посредством обнаружения на электрофореграмме атипично расположенных полос).
Таким образом, обнаружение при SSCP-анализе измененного паттерна миграции фрагментов одноцепочечной ДНК позволяет заподозрить наличие мутации в составе одного из многих изучаемых участков гена, после чего проводится секвенирование данного мутантного образца для точной характеристики нуклеотидных нарушений. Чувствительность SSCP-анализа для детекции неизвестных мутаций зависит от величины анализируемого фрагмента, будучи максимальной (80-95%) при анализе образцов размером от 70 до 200 п.о.
Существует целый ряд других скрининговых методов поиска неизвестных точковых мутаций - гетеродуплексный анализ, метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, метод химического расщепления некомплементарных сайтов и др. [Grompe M., 1993]. Как и SSCP-анализ, они основаны на регистрации некоторых измененных физико-химических свойств амплифицированных мутантных фрагментов ДНК. Во всех случаях после предварительного отбора аномальных образцов наличие мутации подтверждается секвенированием.
В конкретных популяциях мутационный поиск мутации, т.е. мутаций, которые являются преобладающими и обусловливают значительный процент всех случаев заболевания в данной популяции. Наличие мажорных мутаций может быть обусловлено либо эффектом основателя (высокая распространенность конкретной мутантной хромосомы, исторически унаследованной от одного предка), либо частым возникновением одного и того же повреждения и связи с некоторыми особенностями нуклеотидного состава данной области гена (так называемые горячие точки мутаций). Примером такого рода является гепаголентикулярная дегенерация.
При данном аутосомно-рецессивном заболевании описано свыше 100 различных мутаций в сложно организованном гене медной АТФ-азы (АТР7В), что значительно затрудняет мутационный скрининг.
