Антихолинэстеразная активность ФОС. Оценка экспериментальной активности ФОС
Взаимодействие ФОС с ХЭ представляет собой реакцию фосфорилирования, которую можно изобразить схематически: ЕН + (RO)2P(0)X = (RO)2P(0)E + ХН, где EH - активная холинэстераза (механизм взаимодействия ХЭ и ФОС описан выше).
В Н.Олдридж показал, что процесс взаимодействия ФОС с ХЭ подчиняется кинетическим уравнениям простой бимолекулярной реакции, когда один из компонентов (ингибитор) находится в избытке, и может быть описан кинетическим уравнением первого порядка. Скорость реакции прямо пропорциональна концентрации ингибитора. Реакция протекает во времени, чем дольше ингибитор контактирует с ХЭ, тем больше торможение активности фермента. Степень ингибирования ХЭ определяется по молярной концентрации ингибитора, вызывающей торможение фермента на 50 %, а величина pI50 является отрицательным десятичным логарифмом I50* Оба параметра изменяются во времени. Поэтому они могут быть определены только при условии, если продолжительность инкубации известна. Более достоверным параметром для определения "силы" ингибитора (т.е. сродства с активным центром ХЭ) является бимолекулярная константа скорости К2 при определенных температуре и рН.
Уравнение первого порядка справедливо, когда отношение ингибитора к ферменту не меньше чем 25:1. Если это условие не соблюдается, то для описания зависимости степени торможения от времени и концентрации используют кинетическое уравнение второго порядка. Взаимодействие ФОС и ХЭ является химической реакцией, поэтому скорость этого процесса повышается с возрастанием температуры.
Описан целый ряд примеров, когда реакция ФОС и ХЭ не подчиняется кинетическим уравнениям первого порядка. Это может быть связано с тем, что исследуемое соединение имеет примеси, обладающие антихолинэстераз-ным действием; источник ХЭ недостаточно чист и содержит реакционно-способные ферменты или вещества, которые в реакции с ФОС конкурируют с активным центром ХЭ; молярная концентрация сильного ингибитора незначительно превышает концентрацию активных центров ХЭ либо исследуемое соединение является слабым ингибитором ХЭ; фосфорилированная ХЭ может восстанавливать свою активность благодаря спонтанной реактивации; ингибитор может быть неустойчивым в воде или гидролизоваться ферментами, содержащимися в препарате.
Установлено, что в условиях in vitro с увеличением времени инкубации ингибиторов с ХЭ степень угнетения активности ХЭ нарастает. Значительное угнетение активности фермента отмечается в первые 15 мин инкубации, при более длительном контакте ФОС с ХЭ нарастание степени угнетения фермента выражено менее резко. Оптимальное время инкубации для достижения выраженности угнетения ХЭ составляет 30—60 мин.
Наиболее токсичный в рассматриваемой группе веществ зарин значительно превосходит по антихолинэстеразной активности ДФФ, табун и паратион. При действии зарина и табуна ингибирование активности ХЭ в различных биосубстратах выражено примерно в равной степени. ТЕПФ, ДФФ и паратион угнетают активность ХЭ в большей степени в плазме, чем в эритроцитах, мозге и мышцах.
Указанные соединения обладают выраженным антихолинэстеразным действием и в условиях in vivo. При поступлении в кровь даже малых количеств ФОС происходит угнетение активности ХЭ эритроцитов и плазмы. Однократное воздействие зарина в дозе 0,02 мг/кг вызывает у человека выраженное снижение активности ХЭ плазмы и эритроцитов, при этом отмечаются симптомы острой интоксикации.
Между антихолинэстеразным действием ФОС и их токсичностью не всегда наблюдается паралеллизм. Так, препарат М-74 по токсичности примерно равен тиоловому изомеру меркаптофоса, а его антихолинэстеразная активность по отношению к ХЭ лошадиной сыворотки слабее в 258 раз. Препарат Л-11-6 имеет наибольшую токсичность из всех изученных веществ, а по антихолинэстеразной активности уступает тиоловому изомеру меркаптофоса — по отношению к ХЭ лошадиной сыворотки в 35 раз, ХЭ мозга крыс — в 194 раза. Октаметил менее токсичен, чем тиоловый изомер меркаптофоса, всего в 2,4 раза, а обладает более слабым действием на ХЭ лошадиной сыворотки в 3200 раз. Тиоловый изомер меркаптофоса, препараты М-74, М-82, Л-метиловый, тиофос, метафос имеют слабую антихолинэстеразную активность in vitro, однако обладают высокой токсичностью. Этот факт можно объяснить тем, что в организме теплокровных животных они метаболизируются в более сильные антихолинэстеразные вещества.
Сопоставление данных об антихолинэстеразной активности ФОС in vitro их токсичностью и антихолинэстеразными свойствами in vivo показывает, что между этими свойствами не всегда имеется прямая зависимость. Это касается в первую очередь тиофосфатов (фосфоротиоатов). Например, такие тиофосфаты, как тиофос, карбофос, ЭПН, не вызывают угнетение холинэстеразы in vitro, однако эти соединения отличаются выраженными антихолинэстеразными свойствами in vivo и высокой токсичностью.
