Векторы для переноса генов. Ретровирусы и аденовирусы в качестве векторов
Трансфекция соответствующих клеток-мишеней является первым решающим этапом процесса переноса генов, поэтому разработка методов переноса генов представляет собой огромное поле для исследований. В работах по переносу генов в клетки сосудистой системы используют как вирусные, так и безвирусные векторы. Общей особенностью этих методов является эффективная доставка генов в клетки. Однако векторы различаются по способам процессинга чужеродной ДНК и частоте интеграции в хромосомную ДНК.
В случае ретровирусных и лентивирусных векторов переносимые последовательности стабильно интегрируются в хромосомную ДНК клетки-мишени. Эти векторы чаще всего рассматривают с точки зрения их применения лля генной терапии в условиях ex vivo. Осуществление переноса генов с помощью других методов приводит к внедрению чужеродной ДНК в ядро клетки-мишени в неинтегрированной форме. Этими методами удается получить высокую, но временную экспрессию гена. Такие векторы, в т.ч. аденовирус, аденосвязанный вирус и катионные липосомы, используют в основном для изучения переноса генов в условиях in vivo.
Ретровирусы были первыми векторами, которые в 1980-х гг. использовали для изучения переноса генов. Первоначальный интерес к ретровирусам был связан с чем, что эти векторы стабильно трансдуцируют 100% пролиферирующих и культуре клеток-мишений. Сначала рстропируспые векторы использовали при изучении переноса генов сосудистой системы п основном в исследованиях ex vivo, однако их применение было ограничено низкой эффективностью трансфекции.
Недавно ретровирусные векторы нашли применение в клинических исследованиях по генной терапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита. К сожалению, в одном из исследований у двух детей выявили осложнение в виде внедрения ретровируса и онкогенный сайт хромосомы X, что привело к развитию лейкемии.
Аденовирусы типа 2 и 5 — это два серотипа, которые используют в качестве векторов при переносе генов ССС. Геном аденовируса представлен линейной двухцепочечной ДНК длиной 36 тыс. п.н., разделенной на генетической карте на 100 единиц, длина каждой из которых составляет 360 п.н. И конце генома молекула ДНК содержит короткие инвертированные терминальные повторы (ITR, inverted terminal repeats), необходимые для репликации вирусной ДНК.
Продукты гена организуются в «ранние» (Е1-Е4) и «поздние» области на основании экспрессии до инициации репликации ДНК и после нее. Жизненный цикл аденовирусов характеризуется быстрым растворением в соматических клетках: связываясь со специфическим гликопротеиновым рецептором на поверхности клеток млекопитающих, они проникают в клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Белки внешней оболочки аденовируса (капсиды) защищают его от лизосомальной деградации, и вирусная ДНК переносится в ядро.
Экспрессия вирусных генов зависит от клеточных факторов транскрипции и экспрессии участка Е1 аденовируса, который кодирует экспрессию трансактиватора вирусного гена.
Во время лизирующей инфекции происходит репликация вирусного генома в количестве нескольких тысяч копий на клетку. Геном вируса ассоциируется с белками ядра и упаковывается в капсиды путем самосборки основных капсидпых белков.
Репликация генома аденовируса происходит неполностью, что недостаточно для генерации вектора. Векторы конструируются посредством гомологичной рекомбинации в клеточной линии 293 путем котрансфекции: (1) бактериальной плазмиды, содержащей целевую кДНК и короткую последовательность аденовирусного генома, вырезанного из участков Е1А и Е1В (эти участки регулируют аденовирусную транскрипцию и необходимы для репликации вируса); (2) неполного аденовирусного генома.
В результате гомологичной рекомбинации между двумя молекулами ДНК образуется рекомбипантный геном, в котором чужеродный ген замещает участок Е1. Далее вирусный штамм репродуцируется в клетки линии 293 до достижения высокого титра, обычно 109-1010 бляшкообразующих единиц (pin, plaque forming units) на 1 мл.
Аденовирусные векторы обладают рядом дополнительных преимуществ, включая способность эффективно инфицировать клетки млекопитающих и экспрессировать в неделящиеся клетки как in vitro, так и in vivo. Эти векторы относительно стабильны и могут достигать высоких титров. Внехромосомная репликация вектора существенно снижает вероятность мутации путем случайной интеграции и дизрегуляции генов в клетках хозяина. Однако ряд присущих им недостатков ограничивает их применение в качестве векторов для переноса генов. Экспрессия генов в клетках кровеносных сосудов и миокарда после их инфицировании аденовирусом продолжается недолго (всего несколько недель). Иммунная реакция хозяина на аденовирусные белки существенно ограничивает их использование в условиях in vivo.
Низкий уровень нейтрализующих антител вряд ли способен вызвать нежелательные клинические проявления, однако остается неясным, сможет ли иммунный ответ хозяина на аденовирус препятствовать повторному введению аденовируса того же серотипа. Рекомбинантные аденовирсуные векторы первого поколения (деления генов Е1А и Е1В и частичная деления генов ЕЗ) применяли в клинических исследованиях с целью генной терапии, хотя па животных моделях наблюдали ассоциацию этих векторов с воспалением тканей, особенно в печени и легких. Прямое взаимодействие больной печени с аденовирусными векторами высокого титра было высокотоксичным, а в одном случае оказалось смертельным. Инактивация гена Е2А удлиняла время экспрессии гена и сопровождалась снижением воспалительного процесса в печени и легких.
В исследованиях по переносу генов с помощью аденовирусных векторов в адвентиции периферических и легочных артерий наблюдали инфильтраты мононуклеарных воспалительных клеток, однако некроз или васкулит отсутствовали. Инфицирование легочных артерий аденовирусом ассоциировалось со слабо выраженным периваскулярным воспалением; в легочных артериях, обработанных физраствором или липосомами, также обнаруживали небольшое накопление периваскулярных мопонуклеарных клеток. Несмотря на ограниченный иммунный ответ на капсидные белки аденовирусов, аденовирусные векторы кажутся привлекательным средством переноса генов в условиях in vivo на животных моделях, что связано с высокой эффективностью трансфекции. Будущее покажет, найдут ли аденовирусные векторы применение в клинике.
