В качестве дополнительного к трансгенезу метода изучения роли специфических генов в развитии и физиологии мыши используют делению генов. В исследованиях по делении генов экспрессию одного или нескольких генов «отключают», или «выбивают» (нокаутируют), с целью получения мутантного животного С утратой той или иной функции.
Создание нокаутных мышей имеет следующие этапы: конструкция вектора-мишени, содержащего выбранный ген, несущий делению или нонсенс-мутацию; трансфекция плюрипотентиой эмбриональной стволовой клетки мыши в составе вектора-мишени; гомологичная рекомбинация между трансгенной конструкцией и одной копией эндогенного гена с образованием эмбриональной стволовой клетки с гомозиготной делецией выбранного для исследования гена; введение мутантной эмбриональной стволовой клетки в оплодотворенную бластоцисту мыши; имплантация зародыша в организм суррогатной матери.
В результате рождаются химерные мыши, у которых все ткани, включая гонады, частично происходят из мутантной стволовой клетки, а частично из клеток дикого типа внедренного зародыша. Эти химерные животные скрещивают с животными дикого типа. При оплодотворении яйцеклетки дикого типа мутантной спермой химерных животных получаются гетерозиготные нокаутные мыши, во всех клетках которых одна копия выбранного гена является мутантной, а другая — дикого типа.
Далее гетерозиготные животные скрещиваются друг с другом для получения нокаутных гомозигот, у которых выбранный для анализа ген отсутствует во всех клетках. Отсутствие гена у нокаутных животных реализуется в фенотип, который позволяет определить функцию гена в развитии организма, а также в нормальных физиологических условиях и при патологии. Создание нокаутных мышей технически является более сложной процедурой, чем трансгенез, на ее осуществление обычно уходит 9-12 мес.
Условно нокаутные мыши
Инактивация жизненно важных генов обычно приводит к появлению фенотипов, характеризующихся ранней эмбриональной летальностью, которые в связи с этим трудно анализировать. Для преодоления этих затруднений были разработаны методы «отключения» гканесиецифичных генов и/или инактивации генов на разных стадиях развития.
Часто интерес представляет получение специфических мутаций генов, а не полное их элиминирование. Для создания специфических мутаций в генах дикого типа тоже применяют гомологичную рекомбинацию; разница состоит в том, что эти «включения» представляют собой трансгенную конструкцию, содержащую мутантный ген, а не делению гена. Существуют другие способы с использованием гомологичной рекомбинации, которые позволяют внедрить какой-либо другой или неродственный ген в чужой генетический локус для регуляции нового гена пол контролем промотора выбранного локуса.
Еще одним доступом к осуществлению ткансспецифичной делении генов является использование рекомбинантной системы бактериофага, называемой Cre-lox. Бактериофаг Р1 колирует фермент, называемый Сге, который катализирует рекомбинацию ДНК между двумя специфическими последовательностями (1охР-сайтами), выполняющими функцию рекомбипанионного сигнала. Эта система была адаптирована к мышам путем создания генетической конструкции, где целевой ген фланкиро ван loxP-сайтами (floxed аллель). Мышей, гомозиготных по floxed аллелю, скрещивают с трансгенными животными, экспрессирующими Cre-рекомбиназу специфичным для тканей образом (например, в клетках эндотелия, сосудистых ГМК, КМЦ).
У полученных мышей имеется деления целевого гена только в тканях, экспрессирующих Cre-рекомбиназу. Под контролем тетрациклин-зависимого промотора мышам вводят Cre-трансген, и клетки оказываются запрограммированы таким образом, что деления изучаемого гена будет иметь место только на фоне скармливания животным тетрациклина.
