мРНК участвующие в синтезе антител. Методы изучения мРНК
В настоящее время наметилось два подхода — химический и иммунохимический. В основе первого лежит химическое фракционирование мРНК, выделенных из клеток, продуцирующих иммуноглобулины. Основными этапами являются: выделение из мисломных клеток микросом или связанных с мембранами полирибосом (Stavnezer е. а., 1971; Milstein е. а., 1972); экстракция из них РНК в условиях, предупреждающих их деградацию; фракционирование РНК в градиенте плотности сахарозы; выделение фракций, соответствующих по размерам предполагаемой мРНК; очистка их от рибосомальных РНК на колонках с олиго((1Т)- или поли (У)-целлюлозой (или сефарозой), задерживающих только богатые аденнловыми основаниями мРНК (полиА-мРПК), и исследование биологической активности выделенных фракций.
В ряде случаев для дополнительной очистки препаратов мРНК используется электрофорез в полнакрпламидном геле в присутствии 99%-ного формамида (Farace е. а., 1976; Matthyssens с. а., 1976). С теми или иными вариациями приведенная выше схема используется в настоящее время подавляющим большинством исследователей. Выход индивидуальной полиА-мРНК обычно составляет 0,01% от внесенного количества РНК (Brownlee е. а., 1973). В результате в настоящее время выделено нз плазмоцитом МОРС 70Е, МОРС 21, МОРС 41 несколько мРНК, кодирующих как Н-, так и L-цепи. Чистота большинства этих препаратов не превышает 40—60%.
Лишь одной группе авторов удалось недавно таким способом получить мРНК более чем 90%-ной чистоты (Matthyssens е. а., 1976). Это не удивительно. Использованный метод основан, во-первых, на разделении молекул РНК по их молекулярному весу и, во-вторых, на отделении популяции полиЛ-содержащих РНК от лишенных ее.
Естественно, что в клетках может присутствовать ряд мРНК с аналогичными свойствами, не имеющих отношения к иммуноглобулинам. Все эти РНК неизбежно будут загрязнять препараты индивидуальной иммуноглобулиновой РНК. Очевидно, что в зависимости от относительной доли синтезируемого клетками иммуноглобулина этих примесей будет либо больше, либо меньше.
Поэтому для выделения мРНК из миелом, синтез иммуноглобулинов в которых достигает 30—40% от синтеза всех белков вообще, этот метод может быть использован; в то же время для выделения мРНК, кодирующих синтез иммуноглобулинов, из нормальных лимфоидных тканей, особенно из чрезвычайно гетерогенной по клеточному составу селезенки, он явно непригоден.
Значительно более перспективным, с нашей точки зрения, является иммунохимический подход к решению этой проблемы. Преимущество его заключается в том, что уже первый этап фракционирования предполагает строго специфическое выделение индивидуальных полирибосом с помощью антител к синтезируемому этими полирибосомами белку. Существует три варианта этого метода. Первый — осаждение полирибосом антителами к синтезируемому ими белку в присутствии носителя, т. е. того же самого белка (копреципитация) (Delovitch е. а., 1972; Laskov, Mitelman, 1975).
Второй — обработка полирибосом антителами к синтезируемому ими белку и осаждение полученного комплекса антисывороткой к антителам (непрямая преципитация) (Schechtcr, 1973, 1974а). И третий — извлечение индивидуальных полирибосом с помощью иммуносорбентов, содержащих ковалентно или нековалентно связанные антитела к синтезируемому на полирибосомах белку (Сидорова и др., 1973; Sidorova с. а., 1974; Любимова и др., 1975). Из полученных таким образом индивидуальных полирибосом тем или иным способом экстрагируют полисомные РНК и извлекают мРНК, пропуская эту смесь через колонки с олиго- или поли (У)-целлюлозой. С помощью иммунохимического подхода удалось получить препараты мРНК примерно 95%-ной чистоты.
