Методы ДНК-диагностики в неврологии. Прямая ДНК-диагностика
При этом концентрация и состав геля определяют размер «пор», разрешающую способность геля и некоторые другие его характеристики, влияющие на характер перемещения отрицательно заряженных молекул ДНК в электрическом поле. В подобранных стандартных условиях именно подвилшость молекул ДНК при электрофорезе является ключевым анализируемым параметром, зависящим от конкретных характеристик изучаемого фрагмента ДНК (например, от его величины или конформации). Полиакриламидные гели по сравнению с агарозными обладают значительно более высокой разрешающей способностью, но при этом они более трудоемки с точки зрения приготовления и технической обработки.
Прямая ДНК-диагностика
Разработка принципов ПЦР стала поистине революционизирующим этапом в развитии молекулярной генетики, что нашло свое отражение в присуждении ее автору К. Муллису Нобелевской премии за 1993 год в области биологии и медицины. Метод ПЦР заключается в циклическом синтезе in vitro строго заданных, ограниченных участков ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч п.о. Это позволяет в течение 3-5 часов получить огромное число копий искусственно синтезированных молекул нужной последовательности ДНК (т.е. амплифицироватъ необходимый участок ДНК, являющийся предметом молекулярного анализа).
По сути, метод ПЦР как бы «имитирует» на ограниченном участке гена естественный процесс репликации ДНК, имеющий место in vivo: в состав реакционного раствора с определенной концентрацией ионов магния и рН входит ДНК-матрица, четыре вида дезоксирибонуклеотид-трифосфатов, а также термостабильная ДНК-полимераза, сохраняющая свою активность при нагревании раствора до высоких температур. Реакция инициируется добавляемыми в раствор праймерами - олигонуклеотидными последовательностями, фланкирующими «зону интереса» и играющими роль затравок в процессе комплементарного синтеза ДНК.
Сущность метода ПЦР схематично представлена на рисунке и заключается в циклическом чередовании 3 основных биохимических этапов: 1) денатурация двойной спирали ДНК-матрицы при температуре 95°С; 2) гибридизация (отжиг) одноцепочечной ДНК-матрицы и праймеров при температуре 45-60°С, в процессе которой праймеры распознают комплементарные им участки ДНК-матрицы; 3) полимеризация при температуре 65-72°С, т.е. синтез комплементарной цепи на ДНК-матрице, начинающийся от места гибридизации праймера и происходящий в направлении 5'-»3'.
В последующих циклах вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий. Поскольку синтез каждой из 2 антипараллельных цепей ДНК начинается от места гибридизации праймера, эти места и становятся границами синтезируемого участка. Число указанных циклов в ПЦР составляет обычно от 25 до 40, причем в каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции.
Обычно ПЦР осуществляется в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах (амплификаторах), контролирующих заданные параметры реакции (температура, длительность отдельных этапов, число циклов и т.д.).
Дальнейший анализ продуктов ПЦР в процессе прямой ДНК-диагностики предполагает исследование конкретных особенностей амплифицированного участка гена. Так, нри заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие - по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т.е ДНК-диагностика болезни. Таким же сравнительно простым путем с помощью анализа размеров продуктов ПЦР на электрофореграмме может проводиться прямая детекция делеций и вставок в составе амплифицированного участка гена.
Например, в большинстве случаев аутосомно-доминантной дофа-независимой дистонии у больных имеет место одна и та же типичная гетерозиготная делеция трех нуклеотидов GAG в 5-м экзоне гена DYT1 [Ozelius L. et al., 1997]; таким образом, непосредственное выявление при электрофорезе аномально короткого ПЦР-продукта, отличающегося от нормального фрагмента на 3 п.о., может служить молекулярным подтверждением данного диагноза.
