Микробиологические методы исследования в офтальмологии
Для определения видовой и типовой принадлежности возбудителей внутриглазных бактериальных инфекций, а также чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят микробиологические исследования.
Как известно, надежным методом точного определения видовой и типовой принадлежности возбудителей бактериальных инфекций является бактериологическое исследование, которое включает в себя бактериоскопическое исследование материала от больного, выделение искомого возбудителя в чистой культуре, идентификацию выделенной культуры (изучение морфологии, культуральных, биохимических и антигенных свойств).
При бактериальных инфекциях прежде всего проводят бактериоскопическое исследование материала. Для ориентировочной простой окраски используется, например, метиленовый синий, а затем выполняется дифференциальная окраска по Граму.
При выделении чистой культуры применяют оптимальные среды с установленным рН. В некоторых случаях изменение рН обусловливается ростом бактерий. В таких случаях добавляются буферные смеси, например фосфатный буфер. Важным моментом является создание нужной концентрации кислорода и углекислоты, так как некоторые виды бактерий могут размножаться при пониженной концентрации кислорода (полуаэробные условия), другие — при полном отсутствии кислорода (анаэробные условия). Для некоторых кокков (стафилококки, гонококки) необходимо повышенное содержание углекислоты. Оптимальной температурой для большинства патогенных бактерий является 37 °С.
Для выделения чистой культуры (если материал не сильно загрязнен посторонней флорой) первичный посев делают на простые питательные среды, например мясопептонный агар. При обильной сопутствующей микрофлоре с целью выделения искомого микроба применяют различные диагностические питательные среды: селективные, способствующие росту отдельных групп бактерий и тормозящие рост других; среды обогащения (для накопления бактерий одной группы); дифференциально-диагностические и др.
Идентификацию выделенной культуры бактерий начинают с изучения культуральных свойств — характера роста микробов на плотных и жидких питательных средах. Большинство патогенных бактериальных видов дает пышный рост через 24-36 ч, некоторые виды могут размножаться быстрее (через 10-16 ч). Выделение чистой культуры и изучение морфологии дают возможность определить видовую принадлежность бактерий только ориентировочно.
Для более точной характеристики возбудителя инфекции необходимо определение его биохимической активности, в частности — ферментных свойств. Диагностическое значение имеют четыре группы ферментов:
1) сахаролитические, расщепляющие углеводы;
2) протеолитические, расщепляющие белки;
3) стеатолитические, расщепляющие жиры;
4) окислительно-восстановительные.
В каждом конкретном случае определяют сахаролитические, протеолитические и другие свойства, беря в опыт комбинацию веществ, подлежащих расщеплению. Более подробно методика бактериологического исследования изложена в «Руководстве по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней» и в «Руководстве по клинической лабораторной диагностике».
В микробиологической лаборатории Московского научно-исследовательского института глазных болезней им. Гельмгольца при выполнении подобных исследований используют следующую методику. В качестве простой питательной среды при выделении чистой культуры применяют мясоиептониый бульон с добавлением 0,2% глюкозы. Пробирки с первичными посевами выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 3 сут. Посевы ежедневно просматривают и в случае обнаружения в них роста бактерий проводят бактериоскопическое исследование при окраске метиленовым синим и по Граму. Дальнейшее исследование проводят соответственно микрофлоре.
Если при бактериоскопии обнаруживается стафилококк, то с целью определения его гемолитической активности производят высев материала на кровяной агар, лицитовителазной активности — на желточно-солевый агар. Для определения плазмокоагулирующей активности ставятся реакции со стандартной сухой плазмой кролика. По совокупности результатов изучения гемолитической, лицитовителазной, плазмокоагулирующей активности и наличия пигмента дается заключение о патогенности стафилококка. В случае обнаружения при бактериоскопии грамотрицательных бактерий производится пересев материала на свернутую лошадиную сыворотку и простой агар. По характеру роста и наличию пигмента пиоцианина дается заключение о наличие синегнойной палочки.
Если пигмент отсутствует, то по характеру роста на питательной среде определяется кишечная палочка, идентификация которой производится путем пересева материала на среду Эндо.
Определение чувствительности микробов к антибиотикам осуществляется методом диффузии в агар (метод дисков). При определении чувствительности бактерий данным методом на поверхность агара, засеянного испытуемыми микробами, помещают диски, пропитанные антибиотиками. Диски вырабатываются из фильтровального картона и серийно выпускаются отечественной промышленностью. Содержание антибиотика в диске, указанное на этикетке, соответствует рекомендациям ВОЗ. Учет результатов производится путем измерения диаметров задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр последних, с помощью линейки или измерителя. Метод диффузии в агар подробно описан в монографии Ю. Ф. Майчука «Антибиотики в офтальмологии» и в книге С. М. Навашина и И. 1J. Фоминой «Рациональная антибиотикотерапия».
При определении чувствительности бактерий, выделенных у пациентов с внутриглазной инфекцией, в качестве тест-микроба служит золотистый стафилококк, выделявшийся от больного. Разведение культуры производится соответственно оптическому стандарту мутности, получаемому из Государственного НИИ стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. В качестве питательной среды используют стандартный питательный агар. Для микробов, не растущих на простых питательных средах, к агару добавляют 5% кровь или сыворотку крови. Диски пропитываются различными антибиотиками (всего 18 наименований).
