Значение интегринов и других компонентов внеклеточного матрикса
• Методом гомологичной рекомбинации на мышах проведены эксперименты по изучению последствий нокаута генов, кодирующих более 40 различных белков внеклеточного матрикса и 21 гена интегринов. Нокаут одних генов привел к летальным последствиям, в то время как инактивация других лишь в слабой степени отразилась на фенотипе
• Адресная инактивация гена β1-интегрина показала, что он играет критическую роль в структуре кожи и в развитии эритроцитов
Многие сведения о белках клеточной адгезии и их внеклеточных лигандах получены в экспериментах in vitro, с использованием клеточных культур, изолированных белков, и в условиях, сильно отличающихся от нормального физиологического состояния организма. При таком упрощенном подходе белок часто обладает такими функциями, которые не проявляются в более сложных системах. Поэтому конечная цель состоит в том, чтобы выяснить, как функционируют эти белки в нормальном, здоровом организме.
Для того чтобы понять, каковы функции внеклеточного матрикса и межклеточных контактов в здоровом организме, применялись два общих подхода. Один из них состоит в использовании таких модельных организмов (например, плодовых мушек и червей), цикл развития которых хорошо известен и которые удобны для генетических экспериментов. При обработке этих организмов мутагенами в их клетках образуются различные мутации. Используя организмы с мутантным фенотипом (т. е. организмы с нарушениями развития), был идентифицирован мутировавший ген (или гены).
Еще один, более прямой подход заключается в получении селективной мутации в интересующем нас гене, или же полном выключении его функции (нокаут гена). По мере развития мутантного организма, он исследуется. Наиболее распространенный метод, позволяющий избавиться от какого-либо гена, — гомологичная рекомбинация, проведенная на эмбриональных стволовых клетках. Этот метод был использован применительно к 21 из 27 известных генов интегрина у мышей.
На рисунке ниже показана связь между различными мутациями в интегринах и изменениями фенотипа. Аналогичным образом, проводились эксперименты на мышах с нокаутом генов более 40 различных белков внеклеточного матрикса, включая гликопротеины и сердцевинные белки протеогликанов.
На основании этих исследований мы выяснили, что белки адгезии и внеклеточного матрикса выполняют много важных функций в процессе развития. Выключение функций одних генов (например, β1-интегрина, γ1-цепи ламинина, протеогликана перлекана) приводит к летальным последствиям, в то время как инактивация других (например, α1-интегрина, коллагена типа X, протеогликана декорина) слабо отражается на фенотипе. В последнем случае может проявляться эффект функциональной избыточности, при котором функция отстутствующего интегрина компенсируется другими.
Поскольку традиционный нокаут отражается на гене всех клеток, развивающихся из эмбриона, то летальные мутации делают невозможным оценку функции данного белка во взрослом организме. Например, мышиные эмбрионы с выключенной функцией ламинин γ1 гена остаются жизнеспособными в продолжении не более пяти дней после оплодотворения. Эту проблему можно решить, если разработать процедуру нокаута, при котором во всех тканях, за исключением исследуемых, будет экспрессироваться нормальная копия гена. Такой адресный нокаут проводят, используя индуцируемую генетическую рекомбинацию с участием системы Cre/lох, вместо спонтанной рекомбинации, которая обычно используется для получения линий нокаутных мышей.
Адресный нокаут был использован для исследования функций рецепторов β1-интегрина в коже. Мыши, у которых в кератиноцитах отсутствовал ген β1-интегрина, развивались до взрослых особей, однако у них отмечались многочисленные аномалии: сильное выпадение волос, разрушение волосяных фолликулов, неправильная сборка базальной ламины, замедление сборки полудесмосом и пузырчатость эпидермиса. Такой фенотип отражает функции интегринов и белков внеклеточного матрикса. Клетки кожи, в которых отсутствует β1-интегрин, не образуют многие типы интегриновых рецепторов, что, в свою очередь, не обеспечивает прикрепление таких клеток к базальной ламине и к другим компонентам внеклеточного матрикса. Клетки, неспособные прикрепляться к внеклеточному матриксу, часто оказываются нежизнеспособными, что объясняет развитие у мышей многочисленных аномалий. Например, гибель эпителиальных клеток, образующих волосы, вызывает потерю волос. Исследования, проведенные на таких мышах, показали, что одна из критических функций гена β1-интегрина состоит в организации всех тканей и белков внеклеточного матрикса, включая также и те, которые не связываются с β1-интегрином. Пока вывод такого уровня не удалось бы получить ни на одной из существующих систем in vitro.
В результате дальнейшего развития метода индуцированного нокаута стало возможным инактивировать гены во взрослом здоровом организме. Эта система была использована для удаления гена β1-интегрина из предшественников эритроцитов у эмбрионов мышей и взрослых животных, и было показано блокирование адгезивных свойств и миграции этих клеток в костный мозг. Эксперименты продемонстрировали, что для хоминга предшественников эритроцитов необходим β1-интегрин. Таким образом, получение различных нулевых мутантов этого интегрина позволило выяснить его роль в отдельных тканях и в различные периоды развития организма.
Фенотипические проявления мутаций интегриновых генов у мышей.
Изменения фенотипа у мышей при нокауте генов белков внеклеточного матрикса.
