МедУнивер - MedUniver.com Все разделы сайта Видео по медицине Книги по медицине Форум консультаций врачей  
Рекомендуем:
Генетика:
Генетика
Аномалии хромосом
Биология клетки
Генетика врожденных пороков
Генетика рака - опухолей
Молекулярная генетика
Наследственные синдромы
Цитогенетика - исследование хромосом
Лечение наследственных болезней
Фармакогенетика
Форум
 

Сборка нуклеосом при репликации ДНК и хроматина

• При репликации не сохраняются октамеры гистонов, однако димеры Н2А-Н2В и тетрамеры Н32-Н42 сохраняются

• Существуют различные и независимые от репликации пути сборки нуклеосом при репликации

• Для облегчения процесса сборки нуклеосом требуются дополнительные белки

• CAF-1 представляет собой белок сборки, связанный с PCNA субъединицей реплисомы. Этот белок необходим для поддержания тетрамеров Н32-Н42 после репликации

• Для сборки, независимой от репликации, может использоваться другой белок сборки и вариантная форма гистона Н3

При репликации происходит разделение цепей ДНК, и при этом структура нуклеосомы неизбежно должна нарушаться. Репликативная вилка обладает характерной структурой. Она более устойчива к микрококковой нук-леазе и при ферментативной обработке дает полосы, по размеру отличающиеся от ДНК нуклеосом. Область с такой измененной структурой находится в непосредственной близости от репликативной вилки. Это позволяет считать, что в репликации ДНК участвует крупный белковый комплекс, причем по мере его продвижения за ним довольно быстро реформируются нуклеосомы. Это иллюстрируется на микрофотографии, на которой показан участок недавно реплицированной ДНК, уже упакованный в нуклеосомы на обоих дочерних дуплексных сегментах.

Поэтому биохимический анализ и непосредственные наблюдения над репликативной вилкой позволяют считать, что нарушение структуры нуклеосом ограничено коротким участком, находящимся рядом с вилкой. При росте вилки нуклеосомы разрушаются, однако по мере продвижения вилки они очень быстро образуются на дочерних дуплексах. Фактически сборка нуклеосом прямо связана с реплисомой, где происходит репликация ДНК.

Каким образом гистоны связываются с ДНК, образуя нуклеосомы? Образуют ли гистоны вначале октамер белков, вокруг которого впоследствии оборачивается ДНК? Или же октамер собирается на ДНК из свободных гистонов? На рисунке ниже показано, что, в зависимости от конкретных условий, in vitro могут использоваться две схемы сборки нуклеосом. Согласно первой схеме, с ДНК связывается уже сформированный октамер. Вторая схема предполагает, что вначале образуется тетрамер Н32-Н42, к которому затем добавляются два димера Н2А-Н2В. Обе схемы имеют отношение к процессам, происходящим in vivo. Первая отражает способность хроматина к перестройке, которая обеспечивается движением октамера гистонов по ДНК. Вторая схема соответствует событиям, происходящим при репликации.

Нуклеосомы
Реплицирующаяся ДНК сразу же включается в состав нуклеосом.

Связыванию гистонов с ДНК способствуют дополнительные белки. Эти белки можно идентифицировать в экстрактах, участвующих в сборке гистонов и экзогенной ДНК в нуклеосомы. Дополнительные белки могут выполнять роль «молекулярных шаперонов», которые связываются с гистонами, чтобы контролировать связывание индивидуальных гистонов или их комплексов (Н32-Н42 или Н2А-Н2В) с ДНК. Это может оказаться необходимым, поскольку гистоны, являясь основными белками, вообще проявляют высокое сродство к ДНК. При таком взаимодействии гистоны образуют нуклеосомы, минуя промежуточные продукты (т. е. не участвуя в образовании других компактных комплексов, которые могут возникать при их связывании с ДНК).

Предложена система, позволяющая воспроизвести процесс сборки нуклеосом при репликации. Эта система использует экстракты клеток человека, которые реплицируют ДНК SV40 и осуществляют сборку хроматина. Сборка преимущественно происходит на реплицирующейся ДНК. Неообходимо присутствие дополнительного фактора, CAF-1, состоящего из > 5 субъединиц, с общей массой 238 кДа. Этот фактор попадает в область репликативной вилки под действием PCNA, который является процессивным фактором ДНК полимеразы. Таким образом обеспечивается связь между репликацией ДНК и сборкой нуклеосом, причем сборка происходит сразу же после завершения репликации.

CAF-1 стехиометрически связывается с вновь синтезированными Н3 и Н4. Это позволяет предполагать, что при сборке новых нуклеосом вначале образуется Н32-Н42 тетрамер, к которому затем добавляются Н2А-Н2В димеры. Образующиеся in vitro нуклеосомы характеризуются длиной повтора 200 пн, хотя и не имеют Н1 гистона. Это позволяет предполагать, что надлежащее расположение нуклеосом может обеспечиваться и без участия гистона Н1.

При репродукции хроматина происходит репликация релаксированной ДНК, уже связанной с нуклео-сомами. При этом образуются два дочерних дуплекса. Что происходит в этот момент с предсуществующими нуклеосомами? Диссоциирует ли октамер гистонов на свободные белки, которые потом утилизируются, или же гистоны остаются связанными? Ответить на этот вопрос можно, выращивая клетки в среде, содержащей тяжелые (меченные дейтерием) аминокислоты, и переводя их на среду с легкими аминокислотами непосредственно перед репликацией. При последующем использовании сшивающих агентов можно выяснить, входят ли в белки октамера только один или оба типа аминокислот. Полученные результаты позволяют предполагать, что перед репликацией происходит смешивание гистонов, синтезированных до репликации, с синтезированными при репликации гистонами. Это говорит в пользу по крайней мере частичной диссоциации и реассоциации компонентов октамера.

Процесс сборки и разборки нуклеосом трудно охарактеризовать детально, однако на рисунке ниже представлена наша рабочая модель. Репликативная вилка смещает октамер гистонов, который диссоциирует на Н32-Н42 тетрамер и Н2А-Н2В димер. Эти «старые» тетрамеры и димеры поступают в общий пул, который также содержит «новые» тетрамеры и димеры, собранные из ново-синтезированных гистонов. Нуклеосомы собираются на расстоянии примерно 600 пн за репликативной вилкой. Сборка начинается, когда Н32-Н42 тетрамеры связываются с каждым из дочерних дуплексов, при участии дополнительного белка CAF-1. Затем два димера Н2А-Н2В связываются с каждым Н32-Н42 тетрамером и образуют полный октамер гистонов. Сборка тетрамеров и димеров носит случайный характер по отношению к утилизации «старых» и «новых» субъединиц. Это объясняет, почему в октамере смешаны «старые» и «новые» гистоны. Возможно, что нуклеосомы разрушаются и собираются аналогичным образом и при транскрипции.

В клетках эукариот, находящихся в S-фазе (т. е. в периоде репликации ДНК), дупликация хроматина требует синтеза большого количества гистонов для упаковки всего генома — фактически должно быть синтезировано такое же количество гистонов, которое уже содержится в нуклеосомах. Синтез гистоновой иРНК находится под контролем клеточного цикла и сильно увеличивается в S-фазе. Схема сборки хроматина в S-фазе из равной смеси старых и новых гистонов носит название пути, связанного с репликацией (RC).

Другой путь называется независимым от репликации (RI) и используется при сборке нуклеосом в остальные фазы клеточного цикла, вне синтеза ДНК. Использование этого пути становится необходимым при возникновении повреждений в ДНК или при смещении нуклеосом в результате транскрипции. Очевидно, в этом случае процесс сборки должен отличаться от пути RC, поскольку он не связан с репликативным аппаратом. Одна из наиболее интересных особенностей пути, независимого от репликации, заключается в том, что в нем участвуют различные варианты некоторых гистонов из числа тех, которые используются при репликации.

Н3.3 вариант отличается от консервативного гистона Н3 положением четырех аминокислот. В дифференцирующихся клетках, в которых не происходит репликации ДНК, этот вариант гистона постепенно замещает гистон Н3. Это происходит в результате сборки новых октамеров гистонов взамен тех, которые в силу разных причин были удалены из структуры хроматина. Механизм использования Н3.3 в независимом от репликации пути в двух исследованных случаях оказался различным.

Использование гистонов организмом простейшего Tetrahymena определяется исключительно их доступностью. Гистон Н3 синтезируется только в клеточном цикле, вариант этого гистона — только в неделящихся клетках. Однако у Drosophila существует механизм, обеспечивающий использование Н3.3 по схеме RI. Новые нуклеосомы, содержащие Н3.3, собираются на месте транскрипции, предположительно замещая нуклеосомы, смещенные РНК полимеразой. В процессе сборки гистоны Н3 и Н3.3 распознаются по структуре, и Н3 в сборке не участвует. Наоборот, при сборке по пути RC используются оба варианта гистона Н3 (хотя Н3.3 доступен в гораздо меньших количествах, чем Н3, и поэтому входит только в небольшое количество нуклеосом).

По-видимому, белок CAF-1 не участвует в сборке по схеме RI. (Также в таких организмах, как дрожжи и Arabidopsis, ген, кодирующий этот белок, не играет существеной роли, что позволяет предполагать существование альтернативных процессов сборки по схеме RC.) Белок, возможно участвующий в сборке по пути RI, называется HIRA. Исключение этого белка из бесклеточной системы сборки нуклеосом приводит к ингибированию их образования на нереплицирующейся, но не на реплицирующейся ДНК. Это является свидетельством того, что оба пути действительно используют различные механизмы сборки хроматина.

Сборка нуклеосом, содержащих альтернативный вариант гистона Н3, происходит также на центромерах. В ходе репликативной фазы клеточного цикла ДНК центромеры реплицируется рано (в противоположность окружающим гетерохроматиновым последовательностям, которые реплицируются позже. Включение Н3 в центромерную область подавляется, и вместо него у высших эукариот включается белок, называемый CENP-A (у Drosophila он называется Cid, а у дрожжей Cse4p). Это происходит с участием RI-пути сборки, что связано с блокировкой пути RC в течение короткого промежутка времени, пока реплицируется ДНК центромеры.

Октамеры гистонов
In vitro ДНК может или непосредственно взаимодействовать с интактным (сшитым) октамером гистонов,
или связываться с Н32-Н42 тетрамером, после чего к комплексу добавляются Н2А-Н2В димеры гистонов.
Октамеры гистонов
При движении репликативной вилки октамеры гистонов удаляются с ДНК.
Они диссоциируют на тетрамеры Н3-Н4 и димеры Н2А-Н2В. Вновь синтезированные гистоны собираются в Н33-Н4 тетрамеры и Н2А-Н2В димеры.
Предсуществующие и вновь образованные тетрамеры и димеры собираются с помощью белка CAF-1 случайным образом;
при этом новые нуклеосомы образуются непосредственно за репликативной вилкой.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

- Также рекомендуем "Позиционирование нуклеосом на ДНК"

Оглавление темы "Нуклеосомы":
  1. Структура ДНК нуклеосом
  2. Строение октамера гистонов нуклеосомы
  3. Строение фибрилл хроматина и их нуклеосомы
  4. Сборка нуклеосом при репликации ДНК и хроматина
  5. Позиционирование нуклеосом на ДНК
  6. Структура домена ДНК с активными генами
  7. Все ли гены организованы в нуклеосомы?
  8. Механизм удаления гистонов с нуклеосом при транскрипции
  9. Факторы удаления и сборки гистонов нуклеосом
  10. Сайты ДНК с повышенной чувствительностью к ДНКазе (нуклеазе)
Медунивер Мы в Telegram Мы в YouTube Мы в VK Форум консультаций врачей Контакты, реклама
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.