Совершенно другой подход к идентификации генетического вклада в комплексные заболевания применяют при обнаружении конкретных аллелей, связанных с болезнью. Присутствие конкретного аллеля в локусе с повышенной или сниженной частотой у больных по сравнению с группой контроля известно как ассоциация с болезнью.
При анализе ассоциации частота конкретного аллеля (например гаплотип HLA или конкретный SNP, или гаплотип SNP), сравнивают среди больных и здоровых в популяции.
Если дизайн исследования — анализ типа случай-контроль, в котором индивидуумов с болезнью, выбранных из популяции, сопоставляют с контрольной группой без болезни, и генотипы индивидуумов в двух группах определены, то ассоциацию между болезнью и генотипом затем вычисляют по отношению шансов. Шансы сами по себе — это отношение.
Согласно приведенной таблице, шансы иметь клиническую картину болезни у носителей аллеля равны числу больных носителей аллеля (а), деленному на число здоровых носителей аллеля (b). Аналогично, шансы быть больным у неносителя аллеля равны количеству больных-неносителей (с), деленному на количество здоровых неносителей (d). Отношение шансов болезни вычисляют как отношение этих отношений: Отношение шансов = a/b/c/d=ad/be.
Примечание. a — количество больных с аллелем; b — количество здоровых с аллелем; с — количество больных без аллеля; d — количество здоровых без аллеля.
Если исследование спланировано как поперечное или как когортное, при которых берут случайную выборку из всей популяции, анализируемую как на наличие болезни, так и на присутствие генотипа восприимчивости, выраженность ассоциации можно оценивать с помощью относительного риска. Относительный риск сравнивает частоту болезни у всех носителей аллеля восприимчивости [а/(а+b)] с частотой болезни у тех, кто не несет аллеля восприимчивости ([c/(c+d)].
Относительный риск = a/(a+b)/c/(c+d).
Относительный риск приблизительно равен отношению шансов, если болезнь редкая (т.е. а < b и с < d). (He путайте с hr — коэффициентом риска у родственников; hr — распространенность конкретного фенотипа болезни среди родственников конкретного больного по сравнению с общей популяцией).
Значимость любой ассоциации может быть оценена одним из двух способов. Первый — нужно просто оценить, отличаются ли частоты а, b, с и d от ожидаемых, если бы не было никакой ассоциации, методом h2. Второй способ заключается в расчете 95% доверительного интервала для относительного риска. Этот интервал показывает, в каком диапазоне может быть в популяции значение относительного риска в 95% случаев.
Если частота аллеля окажется равной у пациентов и в группе контроля, относительный риск будет равен 1. Следовательно, когда 95% доверительный интервал не включает величину 1, относительный риск отклоняется от ожидаемого при отсутствии ассоциации со значением р < 0,05.
Например, предположим, что в исследовании случай-контроль группа из 120 пациентов с иЦВТ и из 120 соответствующих участников группы контроля генотипированы для поиска аллеля 20210G>A в гене протромбина.
Есть значимое преобладание числа пациентов, несущих аллель 20210G>A по сравнению с группой контроля (h2=15 при числе степеней свободы 1; р<10-10). Поскольку данное исследование типа случай-контроль для оценки силы ассоциации мы рассчитаем отношение шансов.
Отношение шансов = (23/4)/(97/116)=6,9.
Сила и слабости исследования ассоциации гена с болезнью
Методы определения ассоциации — мощные инструментальные средства для точного определения генов, способствующих развитию генетической болезни, выявляющие не только ген, но и конкретные ответственные аллели. Они также сравнительно легки для выполнения, поскольку нужны образцы только от больных и группы контроля, и нет необходимости в кропотливых семейных исследованиях и сборе образцов от многих членов родословной.
Тем не менее исследования ассоциации следует интерпретировать осторожно, поскольку повышение относительного риска, наблюдаемое при обнаружении аллеля в конкретном локусе, не доказывает, что аллель или даже локус, в котором этот аллель находится, включен в патогенез болезни. Существуют два пути, которыми конкретный аллель может быть связан с болезнью без реального участия в развитии заболевания.
Первый и наиболее серьезный — проблема полностью искусственной ассоциации, вызываемая стратификацией популяции. Если популяция стратифицирована на отдельные субпопуляции (например по этнической принадлежности или религии) и участники одной субпопуляции редко вступают в брак с участниками других субпопуляций, то болезнь, независимо по какой причине более часто встречающаяся в одной субпопуляции, может быть связана (неправильно) с любыми аллелями, которые также окажутся более частыми в этой субпопуляции, чем в популяции в целом.
Ошибка ассоциации из-за стратификации популяции, тем не менее, может быть минимизирована при тщательном подборе группы контроля. Разработаны также методы, не использующие дизайн случай-контроль, но тестирующие ассоциации между болезнью и конкретными аллелями в пределах семей. Для этих методов необходимо не только наличие ассоциации, но и чтобы ассоциированный аллель находился в локусе, связанном с локусом болезни. Такие основанные на исследовании семей ассоциативные методы не подвержены ошибкам, вызываемыми стратификацией.
Во-вторых, ограниченность умозаключения о функциональной значимости ассоциации аллеля с болезнью связана с тем, что множество локусов могут оказаться в неравновесном сцеплении. Предположим, что два тесно сцепленных локуса имеют два аллеля, находящихся в неравновесном сцеплении друг с другом. Это означает, что когда один из аллелей присутствует в гаплотипе, другой также имеет повышенную вероятность присутствия в этом гаплотипе.
Фактически, все аллели с неравновесным сцеплением с аллелем в локусе болезни покажут явную положительную ассоциацию, независимо от того, есть у них какая либо функциональная значимость в развитии болезни или нет. Ассоциации, основанные на неравновесном сцеплении, все же остаются полезными, так как сцепленные аллели, по крайней мере, должны быть в локусах, достаточно близко расположенных к локусу болезни.