Молекулярно-генетические исследования в гематологии - возможности
Основными областями применения молекулярно-генетических методов в гематологии являются:
1) диагностика и мониторинг онкогематологических заболеваний;
2) диагностика генетически обусловленных заболеваний системы крови (гемоглобинопатии, врожденные нарушения гемостаза и др.);
3) выявление возбудителей вирусных инфекций;
4) HLA-типирование перед аллогенной трансплантацией костного мозга.
Методологическая основа молекулярно-генетических методов
Практически все биологические объекты содержат генетический материал, которым являются нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), определяющие индивидуальность живого организма. Генетическая информация записана в ДНК в виде линейной последовательности четырех структурных единиц — оснований нуклеотидов (аденина, тимина, гуанина и цитозина). Молекулярно-генетические методы основаны на анализе последовательности нуклеотидов ДНК и РНК биологических объектов.
Молекула ДНК состоит из двух цепей нуклеотидов, которые связаны между собой водородными связями, образующимися между основаниями комплементарных нуклеотидов. Если в одной цепи находится основание аденин (А), то напротив него в другой цепи может располагаться только тимин (Т), напротив гуанина (Г) — только цитозин (Ц). В этом состоит правило комплементарности, которое представляет собой принцип строения ДНК («двойная спираль»).
Нуклеотидная последовательность одной цепи ДНК комплементарна нуклеотидной последовательности второй цепи.
При нагревании ДНК до 80-100 °С или обработке щелочью она денатурирует, то есть цепи нуклеотидов расходятся, при охлаждении — вновь комплементарно соединяются водородными связями. Если к денатурированной ДНК добавить одноцепочечный фрагмент такой же ДНК, меченный радиоактивным изотопом или флюоресцеином, он будет конкурировать с одной из цепей исследуемой ДНК и в части случаев соединится со второй цепью в участке, которому он комплементарен.
Эта реакция воссоединения комплементарных участков (реакция реассоциации или гибридизации) является основой использования ДНК-зондов для выявления или оценки свойств интересующих генов. В простейшем случае ДНК-зонд — это фрагмент ДНК с присоединенной к нему индикаторной частью, позволяющей определить, что данный фрагмент присоединился к испытуемой ДНК. Используя ДНК-зонды к онкогенам и антионкогенам, можно оценить их количество в геноме опухолевой клетки, то есть выяснить возможное умножение копий гена — амплификацию.
Делеции (потери участков ДНК) характерны для ряда наследственных болезней системы крови и гемобластозов (делеции в глобиновых генах приводят к появлению дефектного гемоглобина в эритроцитах; делеции в антионкогене р53 опухолевых клеток способствуют ускорению опухолевого роста и т. д.). Делеции выявляются с помощью ДНК-гибридизации по изменению размера фрагмента ДНК, соединяющегося с ДНК-зондом. Методом гибридизации могут быть определены также хромосомные транслокации.
Вариантом метода ДНК-гибридизации, который получил широкое распространение при исследовании опухолей и позволяет выявить генетические нарушения в конкретных опухолевых клетках, является метод FISH (fluorescence in situ hybridisation).
Чувствительность методов ДНК-гибридизации не превышает 10-13/г (обнаружение одной опухолевой клетки среди 102-103 нормальных), поэтому в настоящее время они вытесняются полимеразной цепной реакцией. Этот метод имеет значительно более высокую чувствительность (10-18/г) и позволяет обнаруживать одну опухолевую клетку среди 105-106 нормальных.
