Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.
Однослойные культуры клеток, выращенные в многотрубчатом культиваторе, оказались весьма эффективными для получения различных вирусов в больших количествах. В качестве прототипа ниже приведено схематическое описание выращивания вируса в культуре клеток во вращающейся колонне.
Клетки трипсинизированной ткани куриного эмбриона суспендируют в питательной среде Игла, содержащей сыворотку крупного рогатого скота. Культуральный аппарат ставят в вертикальное положение таким образом, чтобы ввод находился на нижней распределительной пластинке. Воздушный фильтр оставляют открытым. В культуральные сосуды (стеклянные трубки) на 1 см2 поверхности вносят по 0,2 мл питательной среды и 5х104 клеток. Стеклянные трубки заполняют на 1/5, что обеспечивает благоприятное соотношение газа и жидкости (4:1).
После этого аппарат с суспензией клеток быстро переворачивают в горизонтальное положение и вращают вокруг продольной оси со скоростью 5 об/ч. При такой угловой скорости клетки равномерно распределяются на поверхности сосуда. Выращивание клеток длится 4-5 дней при температуре 37°С. При этом образуется монослойная культура, которую можно видеть при микроскопическом исследовании. После формирования сплошного слоя культуральное устройство вновь ставят в вертикальное положение и удаляют ростовую питательную среду, а культуру промывают изотоническим солевым раствором.
Вирус ньюкаслской болезни в среде 199 (10 ТЦЦ50/мл), вносят в культураль-ный аппарат (приблизительно 0,01 мл на 1 см2 поверхности), возвращают аппарат в горизонтальное положение и вращают 1—3 ч для адсорбции вируса. Затем монослой промывают поддерживающей средой, вносят ее по 0,2 мл на 1 см2 и аппарат с инфицированной культурой инкубируют в течение необходимого времени для максимального размножения вируса.
Внеклеточный вирус получают путем однократного или повторного слива питательной среды из культурального аппарата в приемник, а связанный с клетками — с помощью раствора трипсин-версена. С этой целью кулыуральный аппарат вращают в течение нескольких минут, чтобы клетки отделились от стенок стеклянных трубок.
Аналогичный трубчатый лабораторный культиватор использовали для выращивания стабильных линий клеток Vero, BS-C-1, IMH-P и первичной культуры клеток куриного эмбриона с целью продукции вирусов кори, краснухи, полно- и герпесвирусов.
Вирусы при изготовлении инактивированной вакцины против болезни Марека выращивали с использованием культиваторов со вставленными в них цилиндрическими стеклянными трубками.
Многодисковые и многотрубчатые культиваторы можно с успехом использовать для массового выращивания различных вирусов на различных клеточных субстратах. С той же целью могут быть применены многолотковые системы фирмы Nunc (Дания) площадью 6000 см2 и батарейные многолотковые системы, объединяющие 40 лотков с общей рабочей поверхностью 24 000 см2. Многолотковые системы можно соединять в любых комбинациях.
Для выращивания вируса краснухи в больших объемах использовали реактор со стеклянными бусами диаметром 3 мм, на которых выращивали клетки Vero. Циркуляция питательной среды (MEM с 10% сыворотки эмбрионов коров) обеспечивалась насосом, газовой фазой служил воздух с 5% С02. При инфицировании вирусом содержание сыворотки в среде снижали до 2%. Вирусную жидкость сливали через каждые 24 ч, заменяя свежей, и хранили при температуре -70°С. Выход вируса составлял 10,0 lg ТЦД50/мл. Титрование вируса по ТЦД50 хорошо коррелировало с определением его концентрации по тесту ИФА.
При изготовлении живых вакцин для ветеринарной практики используют преимущественно однослойные первичные культуры. Такие препараты часто обладают высокой экономичностью (в 1 мл содержится 10-100 и более иммунизирующих доз). Для их производства не требуется больших количеств вирусного материала, вирусы размножают в однослойных статических или роллерных культурах.
В статье приведены основные культуральные вакцины для людей и животных, испытанные в экспериментальных условиях или применяемые в практике.
В ветеринарной практике ряда стран широко применяют культуральные живые вакцины против чумы плотоядных, чумы свиней, ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота, болезни Ауески, ньюкаслской болезни, болезни Марека, катаральной лихорадки овец и ларинготрахеита птиц и др.
Кроме урожая вируса, его антигенности и приживляемости в организме, с клеточным субстратом может быть связана безопасность применения вакцины.
Для широкого применения методов групповой иммунизации животных необходимо значительное увеличение расхода живых вакцин и, соответственно, расширение масштабов их производства. В таком случае, существующие способы размножения вакцинных штаммов следует существенно модернизировать.
Выращивание вируса инфекционной анемии лошадей обычно проводят в культурах лейкоцитов или клеток костного мозга лошади, селезенки эмбриона лошади или постоянной линии клеток кожи лошади (CCL-57), что дает возможность получить антиген, пригодный для диагностики этого заболевания. Продуктивно инфицированные постоянные линии клеток часто используют для получения вируса лейкоза крупного рогатого скота и лейкемии кошек.
С целью повышения активности культуральных антигенов для серологических реакций часто уменьшают объем среды при заражении культур или используют только клетки инфицированных культур в период выраженного цитопатического эффекта, обрабатывая их соответствующим образом.
