Однослойная культура клеток для вирусов. Размножение вирусов в однослойной культуре.
Наибольшее применение в вирусологической практике получили однослойные культуры. В производстве вирусных вакцин, особенно медицинского назначения, до недавнего времени использовали преимущественно однослойные первичные культуры и реже культуры диплоидных клеток. Многие вакцины, используемые в животноводстве, давно готовят с применением постоянных линий клеток.
Для производства живых и инактивированных вакцин во многих странах налажено крупномасштабное производство однослойных культур.
В 1954—1967 гг. в США произведено около 1000 т вирусной суспензии в однослойной первичной культуре клеток почек обезьян. Ее в основном использовали для приготовления инактивированной вакцины против полиомиелита и в меньшей степени для коревой и аденовирусной вакцин.
С технологической точки зрения при промышленном производстве вирусных вакцин наибольший интерес представляет высокая эффективность выращивания клеток и максимальный выход вируса или вирусного антигена. В случае приготовления первичных культур особое внимание следует уделять состоянию животных — доноров ткани.
Известен ряд критических факторов, которые следует учитывать при производстве культуральных вирусных вакцин на основе первичных культур.
Приготовление однослойных культур — трудоемкий процесс. Большие масштабы производства многих культуральных инактивированных вакцин привели к необходимости совершенствования технологии их приготовления.
Технологическая линия для массового выращивания вируса ящура в первичной однослойной культуре клеток почек телят в матрасах Ру емкостью 1 л, смонтированная в 1958 г. в Италии, позволяла получить в неделю 300—400 л вирусной суспензии с титром 107—107,5. Многие технологические процессы были механизированы и дали возможность повысить производительность метода. Однако масштабы производства вирусного сырья и повышение качества инактивированных вакцин требовали дальнейшего совершенствования аппаратуры и технологии промышленных способов выращивания вирусов.
Важным шагом в усовершенствовании метода однослойных культур явилось выращивание клеток во вращающихся круглостенных сосудах. При этом значительно увеличилось соотношение поверхности культивирования (см2) к объему среды (мл), которое достигало примерно 10. Высокая концентрация клеток (8х106 клеток ВНК и 2,4х106 клеток почки теленка) на 1 мл поддерживающей среды неизбежно сказалась на повышении активности вирусных антигенов. Благодаря аппаратурно-технологическим разработкам производительность метода выращивания однослойных культур достигала высокого уровня.
Все операции, связанные с подготовкой посуды, выращиванием клеток и получением вируса, были механизированы. Вращающиеся литровые сосуды с культурой помещали в цилиндрические проволочные кассеты (по 18 в каждую). Кассеты укладывали на стеллажи с вращающимися вальцами. Одна пятиярусная роллерная установка одновременно вмещала 400 проволочных кассет с 7200 вращающимися сосудами. В институте зоопрофилактики в Брешия (Италия) было смонтировано четыре таких установки на 2800 1-литровых бутылей.
До сих пор этот метод с успехом применяют в ряде стран в исследовательских и производственных целях. Для выращивания вируса ящура первоначально применяли первичную культуру клеток почек телят, выращенную в 1 -литровых вращающихся флаконах. Это дало возможность увеличить урожай клеток в 3—3,5 раза по сравнению со статическими культурами в 1-1,5-литровых матрасах. Одновременно возрасли титр вируса, активность комплементсвязывающего антигена и иммуногенность инактивированной вакцины.
В дальнейшем для получения вируса ящура указанным способом широко использовали клетки ВНК-21, выращенные во вращающихся флаконах. Успех во многом зависел от модификации питательной среды. Густые культуры клеток удалось вырастить без смены среды. Введение трисбуфера в период роста культуры обеспечило стабильность рН среды. Высокоочищенные аминокислоты, содержащиеся в среде Игла, были заменены гидролизатом лактальбумина с добавлением гистидина. К этой среде добавляли 10% триптозофосфатного бульона (Дифко) и 10% сыворотки крупного рогатого скота.
Выращивание клеток. Из 7-дневных культур удаляли среду и в каждый сосуд вносили по 20 мл 0,25%-ного раствора трипсина на фосфатнобуферном растворе (рН 7,5).
В период отделения клеток от стекла сосуды вращали при комнатной температуре в течение 20 мин. Клетки ресуспендировали в питательной среде таким образом, чтобы их концентрация в 1 мл приблизительно равнялась 3x105. Полученную суспензию вносили по 100 мл в 2-литровые сосуды. Клеток, выросших в одном сосуде, было достаточно для засева 20 сосудов. В течение первых двух часов для обеспечения равномерного распределения и прикрепления клеток к поверхности стекла сосуды вращали со скоростью 3 об/мин, а в течение последующих семи дней — при 2 об/ч.
Посев 30—40x106 клеток в один сосуд позволял получать через шесть дней 50—75х107-клеток жизнеспособностью выше 95%.
