Организация генетического материала в клетке. Генотип. Что такое генная инженерия? Этапы получения генной продукции.
Организация генетического материала. Гены [от греч. genos, рождение] — единица наследственности, участок ДНК, занимающий специфическое место в хромосоме. С точки зрения генетики, ген — наследуемый фактор и неделимая единица генетического материала. Структурный ген (цистрон) — фрагмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи. В его состав входят лидерная последовательность, кодирующие фрагменты (экзоны), вставочные последовательности (нитроны) и концевая последовательность. Поскольку некоторые белки состоят более чем из одной субъединицы, формулировку «один ген — один фермент» применительно к гетеромультимерному (то есть состоящему из двух и более различных полипептидных субъединиц) белку следует трактовать как «один ген — одна полипептидная цепь».
Генотип — совокупность генов организма. Ещё в древности люди эмпирически использовали закономерности наследования. На основании этого опыта получила развитие селекция [от лат. selectio, выбирать] — наука о методах создания новых сортов растений и пород животных путём отбора и скрещивания. До недавнего времени генотип казался неприступным, не подвластным действиям человека. Открытие структуры генов позволило выделять их в изолированном виде, синтезировать биохимически и даже вводить в организм. Стало возможным воздействие на ген без его выделения из организма. Всё это создало предпосылки для манипулирования генотипом.
В 80-е годы XX века появилось новое понятие — генная инженерия — раздел молекулярной генетики, связанный с конструированием не существующих в природе сочетанин генов при помощи генетических и биохимических методов. Впервые введение чужеродного гена и изменение признаков организма осуществили английские микробиологи О. Эвери, К. Маклёод и М. Мак-Карти (1944). Из клеток пневмококка (серовар III) они выделили трансформирующий фактор (как выяснилось впоследствии, последовательность ДНК). После обработки этим фактором часть непатогенных бактерий серовара IIR превратилась в патогенные, причем именно серовара III. Это была первая демонстрация факта, что некие факторы могут передаваться от клетки к клетке, изменяя её наследственные свойства.
В 1972 г. Пол Берг с сотрудниками сообщили о получении in vitro рекомбинантной ДНК, состоящей из фрагментов разных молекул ДНК — вирусной (в том числе фаговой) и бактериальной. Иными словами, речь шла о получении энзимоло-гнческими методами (при помощи ферментов рестриктаз) синтетической генной конструкции. Позднее были предложены новые методы выявления ДНК: блот-гибридизация, увековечившая ими его создателя Э. Саузерна в английском названии метода southern blotting (1975); методы секвенирования ДНК (анализ первичной последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК), основанные П. Сэнджером. В настоящее время для получения доступного для анализа и дальнейших манипуляций количества фрагмента ДНК применяют метод ПЦР, разработанный Нобелевским лауреатом (1994) американцем Кеем Мюллисом.
Этапы получения генной продукции
Процедура получения и использования синтетической генной продукции, состоит из нескольких этапов.
• Внедрение интересующего исследователей гена (выделенного, модифицированного либо синтезированного) в векторную молекулу ДНК in vitro с помощью рекомбинации. В роли вектора может выступать плазмидная ДНК, либо нуклеиновая кислота вируса или фага. Например, ген ИФН человека вводят в геном бактериофага X.
• Введение рекомбинантной (гибридной) векторной ДНК в клетку. В рассматриваемом примере этот этап заключается в заражении клеток кишечной палочки гибридными фагами.
• Отбор клеток, экспрессирующих введённый ген (молекулярное клонирование)
• Культивирование отобранных клонов.
• Введение чужеродного гена в организм приводит к изменению свойств и признаков последнего, то есть к созданию генно-инженерно модифицированного организма. Модифицированный генно-инженерно организм — клетка, группа клеток или вирус, содержащие генетический материал, полученный с применением методов генной инженерии. Известны три способа воздействия на генотип организма.
• Трансформация бактериальных клеток в результате включения экзогенной ДНК приводит к появлению нового генетического маркёра. Для эукариот аналогичный процесс — трансфекция эукариотических клеток (в связи с тем, что термин «трансформация» обозначает переход в состояние неконтролируемого роста и применяется по отношению к опухолевому перерождению клеток).
• Избирательная инактивация гена («адресное» разрушение гена, антисмысловая блокировка гена или производимой им РНК), позволяющая вывести из строя любой ген внутри клетки. Этот процесс известен также как «нокаутирование» [от англ. to knock out, сбивать с ног], а модифицированные организмы — как нокаутные. Направленное изменение гена (адресный мутагенез in vivo, генная инженерия in vitro — ex vivo) no желанию исследователя.
