Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД). Флюоресцентная нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH)
Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) изначально рассматривали в качестве средства выявления и предотвращения врожденных аномалий путем анализа отдельных бластомеров эмбрионов перед имплантацией. Это имеет смысл, когда есть вероятность рождения ребенка с какими-либо генетическими нарушениями. Первоначально молекулярную преимплантационную генетическую диагностику (ПГД) применяли для определения пола эмбриона у пар, подверженных риску заболеваний, связанных с Х-хромосомой.
Технически преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) состоит из двух этапов: микроманипуляции и биопсии, а также анализа ДНК гамет или зародышей.
Микроманипуляция при биопсии включает механическое вскрытие вителлинового слоя и извлечение одного или двух направительных телец в случае диагностики, относящейся к ооциту или зиготе, либо извлечение бластомера в случае биопсии эмбриона. Данная процедура кратко проиллюстрирована на рис. 39-6. В настоящее время применяют два основных метода анализа ДНК:
• ПЦР — для обнаружения нарушений, вызванных одним геном;
• FISH — для обнаружения анеуплоидии.
Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) позволяет амплифицировать специфическую последовательность ДНК. Это циклический процесс, при котором количество фрагментов ДНК удваивается в каждом цикле, позволяя пронаблюдать за специфическими генами или генными мутациями посредством радиоактивной маркировки, бромида этидия, флюоресцентной или серебристой окраски. Каждый цикл ПЦР разделен на три этапа для увеличения количества специфических затравок последовательностей генов.
Первый этап — двухцепочечная ДНК денатурируется на единичные цепочки под воздействием высоких температур (>90 °С). Второй этап — температура понижается, допуская ренатурацию последовательно-специфической затравки в местах совпадений с одноцепочечной ДНК. Третий этап — термоустойчивая полимераза добавляет и распространяет нуклеотиды из места первичной гибридизации. В общем, данный процесс способствует амплификации специфического гена или мутации при их наличии.
Даже при увеличении числа копий, производимых циклом ПЦР, единичная процедура ПЦР может выявить недостаточный генетический материал для обнаружения гена. Эффективность и специфичность амплификации ДНК можно увеличить путем применения метода «вложенной» ПЦР, состоящего из двух этапов.
Крайне важно понимание того, что многие факторы способны влиять на достоверность ПЦР. Существенно, что многочисленные шаги при проверке качества выполняют для предотвращения ошибочных выводов и увеличения достоверности конечного результата.
Флюоресцентная нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH)
Другим способом анализа хроматина при преимплантационной генетической диагностики (ПГД) служит FISH. Данный метод использует прямо маркированные пробы в сочетании с особой гибридизацией проб меченых нуклеиновых кислот в комплементарные цепочки ДНК в фиксированном образце, где хроматин или хромосомы изолированы. Хроматин из полярных телец или бластомеров можно обрабатывать и фиксировать при FISH.
При данной процедуре клетки фиксируют на предметном стекле микроскопа таким образом, что они разрываются, цитоплазматическое вещество удаляется, хромосомы расширяются и слипаются. Такие хромосомы затем гибридизируются с хромосомно-специфическими флюоресцентными пробами. Используя флюоресцентный микроскоп, можно подсчитать количество специфических хромосом и таким образом идентифицировать нормальные или патологические находки.
В настоящее время с помощью наиболее распространенных проб FISH определяют количество хромосом 13, 16,18,21,22, X и Y в клетках. Как и в случае с ПГД, основанным на ПЦР, при осуществлении скрининга, основанного на FISH, важно соблюдение строгих программ контроля качества.
