Гематология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Гематология:
Гематология
Физиология крови
Методы исследования
Анемии
Острые лейкозы
Миелодиспластические синдромы (МДС)
Хронические лейкозы
Лимфомы
Гистиоцитозы - гистиоцитоз Х
Макроглобулинемии
Коагулопатия
Патология тромбоцитов
Переливание крови
Трансплантация стволовых клеток
Книги по гематологии
Иностранные книги по гематологии
Рекомендуем:
Остальные разделы:
Абдоминальная хирургия
Анатомия человека
Акушерство
Биология
Генетика
Гепатология
Гигиена труда
Гинекология
Гистология
Дерматология
Оз и Оз
Кардиология
Лучевая медицина
Микробиология
Неврология
Неотложная хирургия
Отоларингология
Офтальмология
Профилактика заболеваний
Психология
Пульмонология
Физиология человека
Скорая помощь
Стоматология
Топографическая анатомия
Травматология
Фармакология
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Определение фолатов крови бактериологическим методом - методика, показатели нормы

Принцип определения фолатов крови бактериологическим методом. Lactobacillus casei, микроорганизм, неспособный синтезировать фолаты, по этой причине его развитие (измеримое фотометрическим путем) зависит от количества последних в исследуемом материале. Использование устойчивого к хлорамфениколу штамма и добавление этого антибиотика к исследуемой среде, защищает пробы от заражения другими микроорганизмами и значительно упрощает классическую технику (Davis и сотр.).

Материалы для определения фолатов крови бактериологическим методом. Для испытания использовать лиофилизированный штамм Lactobacillus casei, устойчивый к хлорамфениколу 300 мкг/мл (получаемый как таковой1 или приготовленный в лаборатории).

Специальная культуралъная среда, получаемая как таковая или приготовленная (по Herbert) из: 3,75 г экстракта дрожжей (Difco); 3,75 г протеозапептона (Difco); 5 г глюкозы; 1 г КН2РО4; 50 мл фильтрата помидорного сока (с приведенным к 7 показателем водорода посредством 10% КОН); 0,5 мл Tween 80 (дистилированная вода и этанол, из расчета 1:10); 0,5 мл хлористоводородного L-цистеина; до 250 мл дистилированной воды (вдвое концентрированная среда).

Для использования перемешать в равном количестве, с дистилированной водой, содержащей 600 мкг/мл хлорамфеникола и довести до 7 показатель водорода, с помощью 1% КОН. Хранить в холодильнике.

Специальная для испытания среды, поставляемая как таковая или приготовленная (по Davis и сотр., 1970) из: 800 мл энзиматического гидролизата казеина; 160,0 г глюкозы; 160 г уксуснокислого натрия (безводного); 2,4 г L-аспарагина; 1,6 г хлористоводородного L-цистеина; 0,8 г L-триптофана; 4 г двукалиевого фосфата; 4,0 г монокалиевого фосфата; 1,6 г ДЛ-аланина; 20 мг глютатиона (восстановленного); 40 мг аденина; 40 мг гуанина; 80 мг ксантина (последние три предварительно растворяются в небольшом количестве дважды дистилированной воды с несколькими каплями 10% КОН); 40 г урацила; 8 мг парааминобензойной кислоты; 3,2 мг пантотенового кальция; 3,2 мг никотиновой кислоты; 16 мг хлористоводородного пиридоксина; 1,6 мг хлористоводородного тиамина; 4 мг рибофлавина; 8 мл раствора биотина 10 мкг/мл; 40 мл солевого раствора Б (состоящего из 10 г MgSО4.5H2О; 0,5 г NaCl; 0,5 г MnCS4. Н2О; до 250 мл дистилированнои воды) дистилированнои воды до 4 л (=вдвое концентрированная среда). Хранить в рефрижераторе при температуре —20°С до назначенного для испытания дня.

Раствор хлорамфеникола 0,1% (основа) в 1% этаноле (можно хранить в холодильнике несколько месяцев). 15 мг раствора (чистой) фолиевой кислоты на 100 мл дистилированной воды (в холодильнике, в бутылке из кирочневого стекла, можно хранить несколько месяцев). (Чистая) аскорбиновня кислота в виде порошка.

Лабораторная стекляная посуда: градуированная колба на 1000 мл; 8 градуированных колб на 100 мл; градуированная колба на 50 мл; 2 градуированных цилиндра (на 500 и 50 мл); колба Эрленмайера на 1000 мл; колба Эрленмайера на 500 мл; 4 колба Эрленмайера на 200 мл; 3 градуированные пипетки на 10 мл; 2 градуированные пипетки на 5 мл; 3 градуированные пипетки на 1 мл; 2 микропипетки на 0,1 мл каждая; 100 пробирок по 150 х 16 мм каждая (возможно снабженные крышками из пластмассового материала).

Используются новые материалы, предназначенные исключительно для дозировки фолатов; исходно моются детергентом, повторно полощаются проточной водой, проводятся через 1% раствор соляной кислоты и несколько раз полощаются дистилированной водой, далее наполняются дважды дистилированнои водой и закладываются на 30 мин. в автоклав, при температуре 121 °С; при повторных дозировках требуются лишь полоскание двудистилированной водой и автоклавирование.

Lactobacillus casei для определения фолатов крови

Техника определения фолатов крови бактериологическим методом

Для приготовления проб, подлежащих исследованию отобрать 5 мл крови, без противосвертывающего вещества (в целях дозировки в сыворотке) и 5 мл крови на порошке ЭДТА (5 мг) (в целях дозировки в цельной крови). В пробах без противосвертывающего вещества, после ретракции сгустка, сыворотку отстоять и процентрифугировать (10 мин. при 3000 об/мин.) в виду удаления эритроцитов, затем влить по 1 мл сыворотки в пробирку для гемолиза, содержащую примерно 2,5 мг аскорбиновой кислоты, которая растворяется при взбалтывании; сохранять (неопределенный срок) при —20°С до дня испытания, когда размораживается в условиях комнатной температуры.

Из проб с противосвертывающим веществом (после гомогенизации) отобрать 0,1 мл и слить (для гемолиза) в 1,9 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты (с Tween 80 из раствора 1 : 10 — 1 капля на 100 мл аскорбиновой кислоты); после гомогенизации гемолизирующий препарат хранить до испытания, при температуре —20°С.

Приготовление микроорганизма к испытанию осуществляется путем культуры на заранее приготовленной культуральной среде по отмеченному выше способу, или лучше на среде «Difco», следующим образом: разбавить 3,8 г порошка в 50 мл дистилированной воды (= вдвое концентрированная среда) трехминутным кипячением; по 5 мл этой среды влить в 2—3 пробирки, добавить по 3 мл 1% раствора хлорамфеникола и 2 мл дистилированной воды (для достижения конечной концентрации 300 мкг/ CF/мл); окончательной средой промыть содержимое ампулы с лиофилизи-рованной культурой L. casei, затем ввестах в пробирки со средой; далее пробирки заложить в термостат (+37°С) до момента, когда в их мутности (измеренной по сравнению с дистилированной водой, в зоне 622 нм) наблюдается экстинкция по меньшей мере 1,2 (= примерно 2—3 дня): хранить в холодильнике (+4°С). Через каждые 10—14 дней пересаживать на свежую среду, введением 0,1 мл культуры в 10 мл среды с CF, в остальном — как отмечено выше.

Приготовление инъецируемой массы для испытания делать на кануне. Приготовить культуральную среду, при концентрации 100 мкг хлорамфеникола на мл., в которую ввести 0,2 мл культуры и заложить в термостат (37°С).

Рекомендуется, чтобы в день испытания оптическая плотность инъецируемой массы укладывалась в пределы от 0,825 до 0,875, в противном случае «подогнать» разведением средой испытания или, наоборот, центрифугированием и повторным суспендированием осадка с этой средой (MiUbank и сотр.).

Техника определения фолатов крови бактериологическим методом

Для приготовления среды испытания расчитать необходимое количество вдвое концентрированной среды для испытания из расчета 0,47 г порошка среды «Difco » (или 5 мл приготовленной по формуле среды) на каждое определение, при этом число определений включает: 8 стандартных разбавлений + 2 контрольные прибы + количество подлежащих исследованию проб (предпочтительно в двойном экземпляре) + одна или две запасные пробы.

Взвесить необходимое количество порошка, растворить в двудистилированной воде из расчета 9,4 г порошка на 100 мл воды и кипятить 3 минуты, оставить для охлаждения (в колбе, закупоренной пробкой из стерильной ваты).

В другой колбе приготовить одинаковое количество растворителя, состоящего из двудистилированной воды с хлорамфениколом и аскорбиновой кислотой, при этом количество расчитать так, чтобы в окончательной среде концентрация равнялась 10 мкг/мл и 250 мкг/мл соответственно. В этих целях использовать запасный 1‰ раствор хлорамфеникола (0,1 мл на одну пробирку) и 1% свежеприготовленный раствор аскорбиновой кислоты (0,25 мл на одну пробирку). Перемешать растворитель с вдвое концентрированной средой (после охлаждения), прогомогенизировать и отлить в две пробирки по 10 мл этой среды.

Влить в колбу со средой для испытания 0,1 мл инъецируемой массы на 1 л среды. Рекомендуется развести инъецируемую массу со средой для испытания в пропорции 1 : 10 и затем инъецирование соответствующего, точнее измеримого количества (Хоссу). Содержание колбы с введенной средой прогомогенизировать встряхиванием, затем погрузить ез в посуду со льдом и периодически встряхивать в течение всего периода распределения содержимого по пипеткам для проб.

Приготовление стандартного раствора фолиевой кислоты. В градуированной колбе на 1000 мл разбавить 1 мл запасного раствора фолиевой кислоты (15 мг/100 мл) двудистилированной водой, из расчета 1 : 1000. Затем, после безукоризненной гомогенизации отлить в каждую из 8 градуированных колб на 100 мл (помеченных С15 С2, С3.... С8) следующие количества: 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10 и 12 мл; до 100 мл дополнить двудистилированной водой; получим следующие концентрации фолиевой кислоты 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 15, 18 нг/мл; отлично прогомогенизировать.

Приготовление пробирок для испытания. Пробирки для стандартного раствора пометить (C1...С8), для контрольных проб (К1, К2), для сывороточных проб (П1? П2, П3 и т.д.) и для цельной крови (Э1, Э2, Э3 и т.д.), затем разложить по порядку на штатив. Влить в каждую пробирку по 10 мл инъецированной для испытания среды, за исключением пробирки К2, в которую ввести неинъецированную среду.

В пробирки C1...С8 добавить по 0,1 мл соответствующих стандартных растворов, для чего использовать микропипетку на 0,1 мл; прогомогенизировать путем встряхивания. (После каждого эвакуирования микропипетку прополоскать отсасыванием в следующей, по концентрации содержимого, колбе со стандартным раствором)-

В пробирку К2 (с неинъецированной средой для контроля отсутствия заражения) влить 0,1 мл из раствора С8, а в пробирку К1 (с инъецированной средой — контрольной для фотометрии) не вводить материалы, содержащие фолиевую кислоту.

В пробирки, меченные П и Э влить по 0,1 мл соответствующих проб для испытания.

Рекомендуются предварительная гомогенизация проб барботажем, вытирание наружной поверхности микропипетки, выпускание содержимого непосредственно на поверхность жидкости в пробирке, полоскание микропипетки в дистилированной воде, а затем и в последующей пробе, встряхивание пробирок, с пробами для испытания. Когда значения фолата очень малы рекомендуется проводить испытание с двойным количеством материала (0,2 мл).

После повторной гомогенизации пробирки заложить в термостат (37°С), на 18—20 часов.

Фотометрирование проб и расчет результатов определения фолатов крови бактериологическим методом

Использовать спектрофотометр или «Спекол» при длине волны 622 нм, при этом, в качестве контрольной, послужит проба К1 (инъецированная среда, без фолиевой кислоты). В первую очередь фотометрируются пробирки со стандартным раствором, затем подлежащие исследованию пробы, при этом, до заполнения баков, материал гомогенизировать переворачиванием пробирок ло несколько раз. Прочет результатов делать в процентах передачи.

По значениям передачи стандартных растворов нанести на миллиметровую бумагу стандартную кривую по координатной системе, в которой, на абсциссе, обозначить показатели фолата (от 0 до 8 ммкг/мл — по 4 мм на 1 ммкг), а на ординате — проценты передачи (от 100% до 50% или 40% — по 2 см на 10%).

Значения фолата в подлежащих испытанию пробах прочитать посредством интерполяции; что касается проб цельной крови результаты помножить на 20 (= разведению, применяемому в процессе приготовления проб). Значения фолата в эритроцитах вывести из показателей фолата цельной крови и гематокрита, по следующей упрощенной формуле:
ФЭ = Фси х 100/гематокрит (в которой допускается вычитание сывороточного фолата).

Толкование результатов определения фолатов крови бактериологическим методом

Нормальные значения в сыворотке укладываются в пределы от 6 до 20 нг/мл. При фолиевой недостаточности их понижение (до менее 5 нг/мл и менее того) наблюдается на ранних сроках, однако это явление скорее отражает расстройство распределения и использования фолатов, как бывает под влиянием отдельных факторов, таких как воспаление, беременность, недостаточность железа и пр.

Интравитальный гемолиз или «заражение» сывороточной пробы эритроцитами показывают ложно увеличенные, неприемлемые значения, в то время как лечение антибиотиками в период отбора проб может вызвать резкое падение показателя или даже полное отсутствие.

Общий фолат крови (и фолат эритроцитов, расчитанный по его значениям) лучим отражает состояние запасов фолата; нормальные значения укладываются между 50 и 150 нг/мл крови (соответственно 160—640 нг/мл 0); мегалобластоз обычно развивается при показателе общего фолата крови менее 20 (15) нг/мл (ФЭ менее 50 нг/мл).

- Читать далее "Определение выделения с мочой формиминоглютамовой кислоты (FJGlu) - методика, показатели нормы"


Оглавление темы "Методы исследования в гематологии":
  1. Тест гемолиза в подкисленной сыворотке - методика, показатели нормы
  2. Антиглобулиновый тест Кумбса - методика, показатели нормы
  3. Определение витамина В12 в сыворотке бактериологическим методом с помощью Lactobacillus leishmanii - методика, показатели нормы
  4. Определение витамина В12 в сыворотке способом изотопного разбавления покрытыми частицами угля - методика, показатели нормы
  5. Определение метилмалоновой кислоты в моче - методика, показатели нормы
  6. Определение фолатов крови бактериологическим методом - методика, показатели нормы
  7. Определение выделения с мочой формиминоглютамовой кислоты (FJGlu) - методика, показатели нормы
  8. Цитология: методика получения мазка клеток в процессе митоза
  9. Цитология: блокирование митоза на метафазе и дисперсия хромосом
  10. Цитология: исследование хромосом клеток под микроскопом
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта