Определение витамина В12 в сыворотке способом изотопного разбавления покрытыми частицами угля - методика, показатели нормы
Принцип определения витамина В12 в сыворотке частицами угля. Сывороточный витамин В12 (связанный с белками) высвободить путем подкисления и согревания, затем перемешать с определенным количеством радиоактивного витамина В12; добавить присущий фактор (ПФ) (меньшей связывающей силы, чем дополнительное количество радиоактивного витамина В12), излишек несвязанного с ПФ витамина В12 устранить с покрытыми белками частицами угля; радиоактивность надосадочной массы (содержащеай радиоактивныхй и нерадиоактивный витамин В12, связанный с ПФ) сопоставить с таковой у лишенной сыворотки пробы (содержащей лишь радиоактивный витамин В12), при этом количество витамина В12 в сыворотке получим с помощью простого уравнения (Lau, Gottlieb, Wasserman и Herbert).
Материалы определения витамина В12 в сыворотке частицами угля
Приготовить уголь, покрытый белком перемешав одинаковые объемы 5% водянистой взвеси растительного угля ("Norit А" фармацевтической степени) и 1% раствора коровьего серумальбумина (с устранением надосадочной массы и приведением к исходному объему). Можно хранить месяц при температуре +5°С или неопределенный срок — в лиофилизированном состоянии.
Предпочтительно использовать уголь, обвернутый в гемоглобин. Гб приготовить из эритроцитов человека, трижды промытых, 0,9% раствором NaCl, затем гемолизированных в одинаковом объеме дистилированной воды с добавлением толуола (0,5 объема); хороша взболтать 5 минут, процентрифугировать 15 минут при 3000 об./мин., удалить слой толуола и эритроцитный детрит, нижний слой пропустить через фильтровальную бумагу Ватмана № 1. Фильтрат гемоглобина (прозрачный) измерить обычным способом и, с помощью дистилированной воды, довести до концентрации 10 г/100 мл. Применять часть Гб на 20 частей растительного угля (расчет соответственно весу).
Раствор присущего фактора. Рекомендуется "National Formulary Intrinsic Factor (NFIF), из которого приготовляется раствор-запас из расчета 100 мг ПФ на 100 мл 0,9% раствора NaCl (сохраняется при температуре —20°С более года). Разведением 1:100 из раствора-запас приготовляется рабочий раствор (10 мкг ПФ/мл, связывающией способностью примерно 800 пг витамина В12/мл), который можно хранить некоторое время в рефрижераторе. Вместо „NFIF" можно использовать желудочный сок (в запасе) человека в норме, после удаления пепсина.
Стандартный цианкобаламин. Развести в дистилированной воде до концентрации 1000 пг/мл.
Радиоактивный цианкобаламин (СО57В12) специфической активности примерно 11 uCi/uг. Развести в дистилированной воде до концентрации 1000 пг/мл; можно хранить три месяца при температуре +5°С. При каждом определении проводить стандартизацию рабочего раствора (1000 пг/мл) СО57В12 по сравнению с соответствующим «холодным» раствором витамина В12.
При перемешивании 0,5 мл из каждого раствора выявим сокращение точно на 50% связанной с ПФ радиоактивности (пробирка № 3 в описанном ниже способе); большее сокращение свидетельствует о меньшей концентрации раствора Со57В12 и наоборот. Для расчета фактического количества Со57В12 использовать формулу:
пгСо57В12 = пг «холодного» В12 х Б'/(Б — Б'), где: Б = число сцинтиляций в мин. в пробирке с Со57 В12 + ПФ (№ 3), в то время как Б' представляет собой число сцинтиляций в минуту, в пробирке, в которой первый элемент заменен смесью Со57 В12 и «холодного » В12, в одинаковых частях, причем в обоих случаях ввести поправку вычислением радиоактивности надо-садочной массы.
Соляная кислота: раствор 0,25 Н.
Техника определения определения витамина В12 в сыворотке частицами угля
Определение из сыворотки (также из плазмы, при условии, чтобы отбор делали иным путем, чем на гепарине). Используемую стеклянную посуду тщательно вычистить, во избежание любого занесения В12.
Определение проводить (в двойном экземпляре) в пробирках на 10 мл, содержащих четыре разные комбинации реагентов, при этом количество (в мл) и последовательность приемов приведены в таблице.
В пробирках 2 и 4 находятся контрольные пробы надосадочной массы, в которых должно иметься менее 1% добавленной реактивности; пробирка № 3 содержит контрольную пробу ПФ, из которой вытекает связывающая способность ПФ: 5 мкг/0,5 мл раствора.
Расчет результата. Вычесть радиоактивность (= числу сцинтиляций в минуту) контрольных проб надосадочной массы (2 и 4) из значений, полученных от проб 1 и 3. Исправленные таким образом значения дадут сывороточную концентрацию витамина В12, по формуле:
пг В12/мл сыворотки — 2 х пгСо57В12 х (Б/Б'-1),
где: Б представляет собой число сцинтиляций/мин. (с поправкой) в пробирке № 3, в то время как Б' — число сцинтиляций/мин. в пробирке № 1.
Толкование определения витамина В12 в сыворотке частицами угля. Полученные этим методом результаты близки к получаемым по микробиологическому тесту с Euglena Gracillis, и даже чувствительнее последнего для диапазона значений меньше 100 пг/мл.
Нормальные значения колеблются от 200 до 900 пг/мл сыворотки. Явно заниженными рассматриваются значения меньше 100 пг/мл, а расположенные между 100 и 150 пг/мл — показательные в отношении дефицита витамина В12.
Для большей точности в диапазоне значений меньше 200 пг/мл можно использовать большее количество сыворотки или сократить (при соответствующем сокращении количества ПФ) количество добавляемого Со57В12 на 100 пг; и наоборот, для значений более 1500 пг/мл можно уменьшить количество сыворотки или увеличить количество Со57В12 и ПФ. Однако для нужд клинического диагноза такие мероприятия не требуются.
Определение витамина В12 в эритроцитах
Определение витамина В12 в эритроцитах (после предварительного экстрагирования из эритроцитов) проводить по весьма похожей технике (Kelly и Herbert); нормальные значения: 150—250 (100—300) пг/мл. Может лучше отразить положение запасов В12, в частности при «искусственно» повышенном сывороточном уровне. Одинаковый технический принцип применен для определения активности ПФ и исследования анти-ПФ антител в желудочном соке и сыворотке Gottlieb и сотр.).
Определения с помощью разбавления радиоактивными изотопами можно применять и больным, находящимся на лечении антибиотиками.
