Гематология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Гематология:
Гематология
Физиология крови
Методы исследования
Анемии
Острые лейкозы
Миелодиспластические синдромы (МДС)
Хронические лейкозы
Лимфомы
Гистиоцитозы - гистиоцитоз Х
Макроглобулинемии
Коагулопатия
Патология тромбоцитов
Переливание крови
Трансплантация стволовых клеток
Книги по гематологии
Иностранные книги по гематологии
Рекомендуем:
Остальные разделы:
Абдоминальная хирургия
Анатомия человека
Акушерство
Биология
Генетика
Гепатология
Гигиена труда
Гинекология
Гистология
Дерматология
Оз и Оз
Кардиология
Лучевая медицина
Микробиология
Неврология
Неотложная хирургия
Отоларингология
Офтальмология
Профилактика заболеваний
Психология
Пульмонология
Физиология человека
Скорая помощь
Стоматология
Топографическая анатомия
Травматология
Фармакология
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Цитология: исследование хромосом клеток под микроскопом

Нанесение на предметное стекло клеток для исследования хромосом. Известны следующие два варианта рассеивания хромосом на предметном стекле: размозжением (squash) и высушиванием на воздухе (air dried) (Rothfels). Первый способ сложнее с технической точки зрения и представляет следующие недостатки: получаемые препараты носят временный характер, а дисперсия хромосом неодинаковая.

В текущей практике отдается предпочтение второму способу, — нанесение на тонкое предметное стекло, предварительно обезжиринное и храненное в дистилированной воде, при температуре 4°С.

Закрепленная взвесь клеточной массы подвергается повторному суспендированию в небольшом количестве свежеприготовленного закрепителя, в соответствии с клеточной концентрацией. Предметное стекло держать в горизонтальном положении и наносить материал отдельными каплями. Сушка заключается в быстром проведении через пламя или с помощью потока теплого воздуха. Этот последний способ рекомендуется в применении техники бандирования.

Окраска хромосом клеток. Быструю но временную окраску, с немногими морфологическими подробностями, можно осуществить до закрепления с помощью 2% раствора уксуснокислого орцеина; способ применяется в случае приготовления препарата размозжением. В текущей лабораторной практике закрепленные препараты окрашиваются раствором Гимза.

В случае применения способа бандирования окраска по Гимзу делается разно, в зависимости от метода, при этом изменяются концентрация красителя, показатель водорода раствора для растворения, время воздействия, а иногда и температура, при которой делается окраска (Vass). Можно использовать и другие ядерные красители или флюоресцирующие вещества.

Исследование хромосом под микроскоп

Первый этап заключается в выборе метафаз исследования, с учетом их целостности и хорошей дисперсии хромосом. Метафазы, рассматриваемые объективом 10 отмечаются тушью, непосредственно на стекле, нанесением точек или записью деления обоих нониусов микроскопа. При использовании объектива 90 проводим первое подробное исследование метафазы в отношении числа хромосом и возможных структурных аномалий.

Для точности рекомендуется воспроизвести на бумаге метафазы, невооруженным глазом, либо с помощью прожектора или светлой камеры. Часть метафаз, кажущихся нормальными, равно как и аномальные — сфотографировать. Для этого рекомендуются бело-черные пленки очень мелкой зернистости и большой резкости, которую можно усилить применением зеленого фильтра VG4.

Выполнение кариотипа. Каждую, вырезанную из фотографии хромосому наложить на стандартную бумагу, модель которой была установлена на совещании в Денвере в 1960 г. Критерии расположения следующие: длина — в нисходящем порядке, спаривание— равнозначных хромосом. Для распознавания равнозначных пар разработан ряд методов, описание которых дано в нижеследующем.

Описание нормального комплемента хромосомы, его аномалий с соответствующей терминологией были подвергнуты стандартизации на ряде международных совещаний: в Денвере, Лондоне, Чикаго и Париже.

В целях анализа хромосом того или иного человека необходимо исследовать, по меньшей мере (по Turpin) следующее число метафаз: 16 отсчитанных, 6 фотографированных, 2 с составленным кариотипом. Естественно при большом числе исследованных метафаз, результаты точнее. Для исследования случая злокачественного заболевания крови авторами отсчитываются 30 метафаз, из них для 10 составляют кариотип.

исследование хромосом клеток

Методы отождествления однозначных пар хромосом разнообразны:
1) Измерение хромосом. Хромосомные пары характеризуются длиной и положением центромера. Фактическая длина хромосомы колеблется в зависимости от стадии митоза и деспирализации хромосомы. Отдается предпочтение определению относительной длины пары по отношению к общей длине остальных пар, по формуле: Д = длина исследуемой хромосомы/общая длина 22 А + X.

Положение центромера определяют отношение плечей R либо цен-тромерный показатель Iс (Райку, Patau). Итак, хромосомы можно отнести к трем крупным группам: метацентрической или центральной, субметацентрической или дистальной и акрометрической или совершенно дистального расположения центромера.

Метод неточный, поскольку разница по длине отмечается в какой-либо паре или даже плечей той или иной хромосомы, при этом коэффициент колебания равняется 5%.

В 1965 г. Patau, предложил кариограмму в качестве способа графического изображения таких параметров, как длина, отношение плечей, показатель центромера для отождествления однозначных пар.

2) Выявление вторичных сжатий. Многочисленные способы культуры, закрепления или окраски, способствующие блокированию деспирализации хромосом, выявляют вторичные сужения на плечах отдельных пар хромосом (№ 1, 9, 16), в связи с чем их можно распознать. Напоминаем наиболее ходкие способы: добавление к культуре 200 мкг/мл 5-бромдеоксиуридина (БДУР); для последнего закрепления соответствующую смесь приготовить в одинаковой пропорции, или с 50% уксусной кислотой; нанесение на предметном стекле путем высушивания над пламенем.

3) Метод ауторадиографии хромосом. Пары однозначных хромосом характеризуются асинхронным синтезом ДНК. Маркирование этого процесса осуществляется добавлением тимидина, обработанного тритием в культуральную среду, по технике ауторадиографии, ставшей классической (German). Резкое маркирование соответствует относительно позднему завершению процесса синтезирования ДНК, что характеризует, в частности, одну из хромосом X. В основном метод применяется при исследовании половых отклонений.

4) Метод бандирования хромосом. В последнее время уточнился ряд способов выявления отдельных структур хромосом. Эти структуры, называемые полосами, стандартная номенклатура которых была определена на Парижском совещании в 1971 г., характеризуют каждую пару однозначных хромосом. К тому же сохранением тинкториальных характеристик и после перестройки, структурные аномалии хромосом могут быть выявлены и сделано заключение о механизме их образования. До настоящего времени метод бандировашш составляет единственную возможность точного, объективного отождествления хромосом.
В зависимости от применяемого принципа этим способом выявляются различные полосы: Q, G, С, R, Т.

Полосы Q ("quinacrine") флюоресцируют после окраски хинакри-новой горчицей; они указывают на участки с включенным гетерохрома-тином в плечах хромосом (Cassperson). Максимальная флюоресценция наблюдается на длинных плечах хромосомы Y (даже на интерфазе, в виде тельца). Способ применяется для определения пола.

Полосы G (Гимза) одинаковой локализации с Q, но выявляются они окраской по Гимза, после ряда предварительных обработок. Так, например:
а) способы денатурации щелочами, теплом (65°С) (Sumner, Dretz, Schnedl);
б) ферментативное переваривание протеолитическими ферментами, разбавленными в водных растворах, при этом водородный показатель находится на уровне действия фермента, а температура — комнатная: проназа (Dutrillaux), трипсин (Seabright), панкреатин или хемотрипсин (Finaz);
в) комплексоны или культуральная среда без Са++ и Mg++ (Dev);
г) предварительная обработка культуры веществами, влияющими на нуклеопротеины: актиномицин Д (Shafer), тетрациклин (Meisner) или гидроксилмочевина (Попеску).

Техника выполнения несложная, однако нередко наблюдаются морфологические изменения в связи с набуханием хромосом. Текущая практика применяет их больше в области цитогенетики для отождествления однозначных элементов и меньше для выявления структурных аномалий, локализованных в конечных областях хромосом.

Полосы С («центромерные») локализуются на гетерохроматине центромер и на вторичных сужениях. Для их получения продолжить термическое (Arrighi) или энзиматическое денатурирование. Применение ограниченное.

Полосы R ("reverse") указывают на эйхроматические области, следовательно имеют обратный отпечаток, чем полосы Q и G. Выявляются путем бережного теплового денатурирования при 87°С (Dutrillaux), окраской по Гимза, либо оранжевым акридином, с наблюдением в ультрафиолетовом спектре (Couturier). При резкой окраске окончаний хромосом наблюдаются и небольшие структурные перестройки и выявляются хромосомы группы G.

Полосы Т («терминальные») получаются после специальной тепловой обработки и окраски оранжевым акридином (Dutrillaux). Осуществляется более интенсивная флюоресценция отдельных терминальных полос, что дает ценные сведения для исследования структурных перестроек.

Разное маркирование хроматид. Инкубация культур на фазе G1 клеточного цикла с помощью 5-бромдеоксиуридина составляет современную технику выявления межхроматидного взаимообмена (Fischer).

Разные описанные способы применяются со свойственными, каждой цитогенетической лаборатории, изменениями. В принципе лучшие результаты получаются на «устарелых» препаратах либо по истечении времени (5—6 дней с момента нанесения на предметное стекло), либо в результате обработки Н2О2 или шелочами (Seabright). Способ бандирования осуществляется труднее при злокачественных гемопатии, причем результаты различны в зависимости от случая.

- Вернуться в раздел "гематология"


Оглавление темы "Методы исследования в гематологии":
  1. Тест гемолиза в подкисленной сыворотке - методика, показатели нормы
  2. Антиглобулиновый тест Кумбса - методика, показатели нормы
  3. Определение витамина В12 в сыворотке бактериологическим методом с помощью Lactobacillus leishmanii - методика, показатели нормы
  4. Определение витамина В12 в сыворотке способом изотопного разбавления покрытыми частицами угля - методика, показатели нормы
  5. Определение метилмалоновой кислоты в моче - методика, показатели нормы
  6. Определение фолатов крови бактериологическим методом - методика, показатели нормы
  7. Определение выделения с мочой формиминоглютамовой кислоты (FJGlu) - методика, показатели нормы
  8. Цитология: методика получения мазка клеток в процессе митоза
  9. Цитология: блокирование митоза на метафазе и дисперсия хромосом
  10. Цитология: исследование хромосом клеток под микроскопом
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта