Механизм соединения ДНК с ядерным матриксом при помощи MAR (matrix attachment regions)
• ДНК присоединена к ядерному матриксу посредством специфических последовательностей, которые называются MAR- или SAR-последовательности
• МAR-последовательности обогащены АТ-блоками, но у них отсутствуют специфические консенсусные последовательности
Присоединяется ли ДНК к белковому каркасу посредством специфических последовательностей? Сайты ДНК, присоединенные к белковым структурам в интерфазном ядре, называются MAR (matrix attachment regions); иногда их также называют SAR (scaffold attachment regions). К какой структуре интерфазного ядра они присоединяются, неизвестно. Часто хроматин оказывается связанным с ядерным матриксом, и высказывалось много предположений о необходимости такого связывания для протекания транскрипции или репликации.
Когда из ядер удаляют большую часть белков, ДНК остается в виде петель, выходящих из оставшейся структуры, содержащей белки. Однако попытки отождествить белки, обнаруженные в этих препаратах, со структурными элементами в интактных клетках оказались безуспешными.
Соединяются ли с этим матриксом определенные области ДНК? На рисунке ниже представлены схемы экспериментов in vivo и in vitro, позволяющих ответить на этот вопрос. В обоих случаях вначале выделяют ядерный матрикс в виде препаратов неочищенных ядер, содержащих хроматин и ядерные белки.
Затем, используя различные методические подходы характеризуют ДНК матрикса или идентифицируют ДНК, способную к нему присоединяться.
Для анализа MAR-последовательностей путем экстракции белков деконденсируют петельные домены хромосом. Предполагается, что после обработки петель ДНК рестриктазами остаются только MAR-последовательности, присоединенные к матриксу in vivo.
В качестве дополнительного подхода, из матрикса при обработке ДНКазой удаляют всю ДНК и выделенные ее фрагменты используют для исследования их способности связываться с матриксом in vitro.
In vivo и in vitro с матриксом должны связываться одни и те же последовательности Когда идентифицирован потенциальный MAR, методом делеций устанавливается минимальный размер последовательности необходимый для связывания in vitro. После этого можно идентифицировать белки, которые связываются с MAR.
Интересной особенностью MAR является отсутствие участков консервативных последовательностей. Обычно они содержат около 70% АТ-блоков, но не содержат консенсусных последовательностей. Однако часто в областях MAR присутствуют, например, такие функционально важные последовательности, как ^ис-регуляторы транскрипции и сайт узнавания для топоизомеразы II. Не исключено поэтому, что MAR выполняют более чем одну функцию, обеспечивая не только присоединение ДНК к матриксу, но и ее топологические изменения.
Какая взаимосвязь существует между каркасом хромосомы в делящейся клетке и матриксом интерфазной клетки? Идентичные ли последовательности ДНК участвуют в присоединении к этим структурам? В некоторых случаях из метафазных опорных структур можно выделить те же фрагменты ДНК, которые обнаруживаются в ядерном матриксе in vivo. В свою очередь фрагменты, содержащие MAR, способны связываться с метафазными белковыми структурами. По-видимому, ДНК содержит общие сайты связывания, которые в интерфазных клетках связываются с ядерным матриксом, а в митотических — с хромосомным скелетом.
Ядерный матрикс и скелет хромосомы состоят из различных белков, хотя и содержат ряд общих компонентов. Топоизомераза II представляет собой типичный компонент скелета хромосом и присутствует также в ядерном матриксе. Это позволяет предполагать, что топологические характеристики ДНК играют существенную роль для обеих структур.
Регионы ДНК, связанные с матриксом, можно идентифицировать, исследуя ДНК, связанную с матриксом in vivo,
или идентифицируя фрагменты, которые способны связываться с матриксом после удаления из него всей ДНК.