Использование лейцина, фенилаланина для оценки метаболизма белков
Внутривенная инфузия в течение 4-6 час обогащенного L-[1-13С] лейцина (> 95% 13С) стала методом выбора оценки кинетики белка в организме человека. Поскольку лейцин является незаменимой аминокислотой, источником немеченого свободного лейцина, присутствующего в плазме, может быть только экзогенный лейцин, попадающий в организм с пищей или внутривенно (I), или свободный лейцин, образующийся в результате распада белка (В) в организме.
Таким образом, Ra = I + В. С другой стороны, лейцин может только подвергнуться окислению (до СО2 и мочевины) или включиться в синтез белка (S, или неокислительное высвобождение лейцина, NOLD).
В ходе инфузии [13С]лейцина молекулы меченого лейцина пополняют пул свободного лейцина, повторяя путь молекул немеченого лейцина. Благодаря окислению [13С]лейцина в выдыхаемом воздухе появляется 13СО2, а синтез белка приводит к включению [13С]лейцина в белки организма.
Растворение [13С]лейцина в природном пуле лейцина называется его обогащением, поскольку [13С]лейцин уже существует в небольших количествах и инфузия следового количества просто приводит к увеличению пула лейцина сверх исходного содержания в организме. В стабильном состоянии 13С-обогащение пула свободного лейцина отражает отношение скорости инфузии [13С]лейцина (i) к Ra лейцина.
Таким образом, Ra (мкмоль/кг/мин) можно вычислить исходя из разведения [13С]лейцина. Ra = i [(Ei/Ep) - 1], где Ei и Ер (эксцесс, моль%) — 13С-обогащения в вводимом растворе и плазме (соответственно) в стабильном состоянии, а i — скорость следовой инфузии (мкмоль/кг/мин). Поскольку Ra = I + В, то В = Ra - I. При принятом условии постоянства концентрации лейцина в течение всего времени проведения эксперимента Ra = Rd. Путем сбора выдыхаемого воздуха можно определить окисление лейцина (Ох).
Показатель вовлечения лейцина в синтез белка может быть вычислен по формуле: NOLD = Ra - Ох. Все данные впоследствии можно экстраполировать на определение абсолютной скорости синтеза, окисления и расщепления общего белка организма (г белка/кг/сут), поскольку известно, что 1 г белка организма содержит 610 мкмоль лейцина. Для инфузии [13С]лейцина необходима установка двух внутривенных катетеров: один (короткий) катетер обычно вводят в переднюю локтевую вену для введения меченого [13С]лейцина, другой — в контрлатеральную поверхностную вену для взятия анализов крови.
Во время инфузии изотопа рука располагается на подогреваемой подушке для создания эффекта «артериализированной венозной» крови, призванного более точно отражать изменения в смешанной артериальной крови.
Использование [13С]лейцина для оценки метаболизма белка в организме человека.
NOLD — неокислительное высвобождение лейцина;
ППП — полное парентеральное питание.
Некоторые допущения модели [13С]лейцина:
- Отсутствие изотопного эффекта
- Отсутствие метаболического эффекта вводимого меченого атома
- Фракция производимого 13СО2, которая восстанавливается при дыхании, известна
- Отсутствие «рециркулирующих» меченых атомов
- Исход для меченого атома (даже в случае, когда помечен один углерод) равнозначен исходу для всей молекулы
- Пул лейцина в плазме отражает внутриклеточный пул
Модель лейцина основана на нескольких допущениях, большинство из которых выдержали два десятилетия интенсивных проверок и подтвердили свою правильность. Например, не вызывает сомнений, что синтез белка происходит не в плазме, а во внутриклеточном пространстве.
Истинным предшественником лейцина в синтезе белка является тРНК-связанный лейцин, и оценка накопления изотопа во внутриклеточном пространстве предполагает этические и технические затруднения, поскольку связана со взятием биопсийного материала и проведением трудоемкого процесса экстракции интактного тРНК-связанного лейцина. Вместо этого накопление изотопа оценивают по пулуа-кетоизокапроата (KIC), кетокислоты лейцина, который можно назвать суррогатным пулом для тРНК-связанного лейцина.
В ходе инфузии [13С]лейцина он мгновенно трансаминируется в кетокислоту (13С-KIC), попадая во внутриклеточное пространство, причем известно, что этот KIC находится в свободном равновесии с KIC плазмы. Поскольку KIC получается только из лейцина и продуцируется только внутри клеток, 13С-KIC может выступать в роли подходящего суррогатного пула для внутриклеточного лейцина. Количество 13C-KIC можно легко определить. Было обнаружено, что накопление в плазме 13С-КIС происходит примерно на 10-20% медленнее по сравнению с накоплением лейцина. Исследования биопсии тканей, проведенные с участием людей и применением множественных меченых атомов KIC и лейцина, а также опыты на животных доказали, что KIC является достоверным отражением использования пула предшественников лейцина для синтеза белка. Накопление (обогащение) изотопа оценивают с помощью технологии масс-спектрометрии.
IRMS используют для определения очень малого накопления (эксцесс < 0,01 моль%) в относительно чистых газах (например, накопление 13С в выдыхаемом СО2), в то время как газовую хромато-масс-спектрометрию применяют для определения более значимых накоплений (эксцесс > 0,1 моль%) в органических молекулах в сложных структурах (например, в лейцине плазмы или KIC). Наконец, газовая хромато-комбустион-изотопная масс-спектрометрия объединяет способность газовой хроматографии различать множественные «пики» в плазме с возможностью IRMS определять очень малые накопления. При таком подходе газовую хроматографию используют для сепарации органических молекул в сложных структурах (например, лейцина в плазме), когда интересующая молекула превращается "online" в чистый газ (например, в СО2 при 800 С в печи для сгорания) и в дальнейшем уже подвергается анализу с помощью IRMS как газ.
Чтобы оценить окисление лейцина нужно провести непрямую калориметрию для учета всей продукции СО2 и забор проб воздуха как из вентиляционного колпака, так и из контура выдоха, если пациент находится на ИВЛ, для оценки 13СО2-обогащения. Поскольку восстановление производимого в результате метаболических процессов 13СО2 не равно по времени короткой инфузии изотопа, для коррекции неполного восстановления нужен корригирующий фактор. Даже в описанных в литературе случаях, когда восстановление оценивали в 80%, в идеале его нужно было определять отдельно для каждой изучаемой популяции или клинического случая, т.к. его значение может варьировать. Один из способов оценки — проведение короткой (в течение 2 час) инфузии меченого бикарбоната натрия непосредственно перед введением меченого лейцина.
Дополнительное преимущество данного подхода заключается в обеспечении оценки СО2 без проведения непрямой калориметрии.
Сбор воздуха при дыхании представляет собой сложный процесс, поэтому был предложен новый дизайн исследований. Так, поскольку окисление лейцина в конечном итоге ведет к невосполнимой потере аминокислот, некоторые исследователи оценивали окисление [13С] лейцина путем определения экскреции азота мочи во время инфузии [13С]лейцина без взятия проб воздуха.
В качестве альтернативы вместо меченого лейцина может быть введен меченый фенилаланин. Поскольку он является незаменимой аминокислотой, его метаболизм похож на метаболизм лейцина. Единственное отличие — при введении L-[ring-2Н4]фенилаланина немедленным продуктом его окисления является L-[ring-2H4]тирозин, который можно определить в плазме. Отношение [2Н4]тирозина к [2Н5]фенилаланину отражает ту часть продукции тирозина, которая обусловлена окислением фенилаланина. Основное ограничение данного подхода заключается в необходимости комбинировать его с введением отдельного меченого атома, например 13С, в молекуле тирозина для определения Ra всего тирозина.
Несмотря на то что современные методы (например, газовая хромато-масс-спектрометрия) позволяют определять накопление изотопа менее чем в 100 мкл плазмы, забор крови затруднен из этических соображений (если установка катетера обусловлена только необходимостью проведения инфузии изотопа, а не интересами клинического мониторинга). Это стало основанием для поиска альтернативных методов. Схожие параметры были получены при обогащении [13С]лейцином плазмы и мочи. Позднее Darling и соавт. продемонстрировали небольшое различие в обогащении плазмы и мочи, характерное для нескольких аминокислот. Объяснить это можно значительным присутствием D-[13С]аминокислот, являющихся загрязняющими примесями выпускаемых промышленностью меченых атомов.
Появление этих примесей в моче — результат преимущественной экскреции D-аминокислот почечными канальцами, поэтому следует убедиться в оптической чистоте (100%) меченой аминокислоты перед началом сбора мочи.
Для выяснения регуляции кинетики белка у новорожденных при различных условиях была исследована кинетика лейцина. Выявлено, что инсулин у детей с ОНМТ, так же как у взрослых, подавляет протеолиз и снижает синтез белка. Как показали исследования недоношенных детей с респираторным дистресс-синдромом, раннее (начиная с первого дня жизни) внутривенное введение аминокислот по сравнению с традиционной инфузией только глюкозы приводит к улучшению баланса белка посредством стимуляции его синтеза. Ответ организма на постепенное увеличение дозы аминокислот был изучен у клинически стабильных недоношенных детей в первую неделю жизни: в отличие от протеолиза, наблюдаемого у здоровых доношенных новорожденных, зависимого от дозы подавления, эндогенная скорость накопления лейцина не зависела от введения аминокислот.
Поскольку глютамин в растворах относительно нестабилен, традиционно используемые для парентерального питания растворы аминокислот не содержат глютамина. Кроме того, глютамин может быть «условно незаменим» в ситуациях, связанных со значительным стрессом, например в случае детей с ОНМТ, получающих парентеральное питание. Было выявлено, что введение обогащенных глютамином препаратов для парентерального питания снижает окисление лейцина и распад белка у недоношенных детей, находящихся на парентеральном питании.
