Трансляция мРНК. Особенности трансляции мРНК при синтезе антител
Биологическая активность выделенных препаратов мРНК оценивается по их способности синтезировать в бесклеточных системах соответствующие полипептидные цепи. Определяя величину синтеза специфических пептидов по отношению ко всем вновь синтезированным, можно определить также чистоту препарата мРНК. Необходимым условием при этом является использование для мечения белка не какой-нибудь одной аминокислоты, но смеси по меньшей мере из 10 радиоактивных аминокислот и анализ продуктов синтеза методами с высокой разрешающей способностью (например, двумерное картирование пептидов).
Для трансляции мРНК используют бесклеточные системы трех типов: из асцитной гепатомы Кребса (Swan е. а., 1972; Schechter, 1973). ретикулоцитов кролика (Stavnezer, Huang, 1971; Mach e. a., 1973; Cowan е. а., 1976) и проростков пшеницы (Schechter, Burstein, 1976; Storb, Marvin, 1976). Наиболее удобной, по-видимому, является последняя система. Выход меченого предшественника в ней составляет 0,1 пмолей, или 2,6 нг на 0,007 А2во единиц внесенной мРНК (Schechter, Burstein, 1976).
Поскольку на данном этапе задачей описываемых исследований является изучение потенциальной трансляционной способности мРНК, а растительные и животные бесклеточные системы в принципе ведут себя в этом отношении одинаково (Schechter, Burstein, 1976), то степень пригодности и преимуществ той или иной системы, очевидно, определяется следующими тремя параметрами: величиной эндогенного белкового синтеза (чем ниже, тем лучше), доступностью и простотой требуемых ингредиентов и количеством мРНК, которую надо внести в систему для получения достоверного синтеза исследуемого белка.
Аналогом бесклеточной системы иногда служат также ооциты лягушки. Было показано (Smith е. а., 1973), что введение в ооциты мРНК, кодирующей цепи иммуноглобулинов., приводит к синтезу этих цепей. Этот метод, однако, более сложен и требует значительных количеств мРНК.
Большинство опытов по трансляции проведено с мРНК, которые кодируют синтез L-цепей (L-мРНК), так как их выделение значительно проще, чем выделение мРНК, кодирующих синтез Н-цепей (Н-мРНК). Изучение продуктов трансляции мРНК, кодирующих L-цепи миеломных иммуноглобулинов, привело к неожиданному результату. Оказалось, что в бесклеточных системах мРНК кодируют синтез полипептидов (предшественников), больших по размерам, чем зрелые L-цепи. Впервые образование более тяжелого продукта под действием 13S мРНК из клеток плазмоцитомы МОРС 41 описали Сван и соавторы (Swan е. а., 1972), под действием 10—14S мРНК из клеток плазмоцитомы МОРС 21 — Мильштейн и соавторы (Milstein е. а., 1972). Молекулярный вес образующегося продукта был больше молекулярного веса соответствующих L-цепей (на 1500), из чего было сделано заключение о наличии в нем 15 дополнительных аминокислотных остатков.
Поскольку при добавлении к бесклеточной системе 355-формилметионин-тРНК в качестве единственного источника метки 355-метионии обнаруживался в тяжелом компоненте, было сделано заключение, что по крайней мере часть этих дополнительных аминокислот расположена на NH2-коице молекулы L-цепи (у эукариотов синтез полипептидных цепей начинается с включения метионина). В дальнейшем данные о синтезе предшественника были подтверждены в опытах с мРНК» кодирующими синтез x-L-цепей МОРС 70Е (Toncgawa, Baldi, 1973), МРС„ (Storb, Marvin, 1976), МОРС 41 (Mach e. a., 1973), МОРС 321 (Schechter, Burstein, 1976), МОРС 63 (Schechter е. а., 1976) и L-цепей МОРС 104Е (Burstein е. а., 1976).
