Гормоны щитовидной железы и ядро клетки. Определение концентрации гормонов
а) Гормоны щитовидной железы стимулируют процессы транскрипции в ядре клетки. Тиреоидные гормоны тироксин и трийодтиронин обусловливают стимуляцию процессов транскрипции специфических генов в ядре. Осуществляя эту задачу, гормоны связываются с белком-рецептором, локализованным в ядре. Эти рецепторы — преимущественно протеины, расположенные на хромосомах; они одинаково контролируют функцию как промоутеров, так и операторов генов.
Существуют две важные особенности влияния тиреоидных гормонов на ядро клетки.
1. Гормоны активируют генетические механизмы продуцирования многих типов клеточных белков — вероятно, 100 или более. Многие из белков являются ферментами, способствующими усилению метаболической активности практически во всех клетках организма.
2. Однократно связавшись с внутриклеточными рецепторами, гормоны щитовидной железы могут обеспечивать контроль экспрессии гена в течение нескольких дней и даже недель.
б) Определение концентрации гормонов в крови. Большинство гормонов присутствуют в крови в чрезвычайно малых количествах; концентрации некоторых из них составляют одну биллионную миллиграмма (1 пикограмм) в миллилитре крови, поэтому очень трудно определить их концентрацию обычными химическими методами. Чрезвычайно чувствительный метод был предложен около 40 лет назад, который революционизировал способы определения гормонов, их предшественников и их метаболитов в крови. Этот метод называют радиоиммунологическим исследованием.
в) Радиоиммунологическое исследование. На первом этапе радиоиммунологического исследования получают высокоспецифические антитела к гормону, количество которого хотят определить.
На втором этапе:
(1) небольшое количество антител добавляют к раствору, содержащему гормон, количество которого определяют;
(2) одновременно добавляют определенное количество очищенного стандартного гормона, снабженного радиоактивной меткой.
Необходимо соблюдать одно важное условие: антител должно быть недостаточно для полного связывания с радиоактивным гормоном и свободным гормоном, содержащимся в исследуемом растворе, в этом случае свободный гормон в исследуемом растворе и радиоактивный стандартный гормон конкурируют за фрагменты реагирования антител.
В процессе их конкуренции возможность быть связанными с фрагментами реагирования антител пропорциональна концентрации каждого из них в исследуемом растворе.
На третьем этапе (после того, как в процессе связывания с антителами установится равновесие) комплекс антитело-гормон отделяютя от остального раствора, и количество радиоактивного гормона, связанного с антителом в комплексе, определяют обычными радиологическими методами исследования.
Если большое количество радиоактивного гормона оказалось связанным с антителами, то очевидно, что количество свободного гормона, конкурирующего с радиоактивным за связывание с антителами, было мало и, следовательно, его концентрация в исследуемом растворе была низкой. Напротив, если связанным оказалось небольшое количество радиоактивного гормона, это означает, что количество определяемого свободного гормона, конкурировавшего с радиоактивным за связывание с антителами, оказалось большим.
Чтобы сделать определение количественно точным, на четвертом этапе процедуру радиоиммунологического исследования выполняют для стандартных растворов, содержащих нерадиоактивный гормон в разной концентрации. Затем строют стандартную кривую, как показано на рисунке ниже.
Стандартная кривая для радиоиммунологического исследования альдостерона
Путем сопоставления количества радиоактивного гормона в «неизвестном» растворе со стандартной кривой можно определить концентрацию гормона в «неизвестном» растворе с точностью от 10 до 15%. Этим методом могут быть определены такие ничтожно малые количества гормона, как биллионная или даже триллионная часть грамма.
г) Фермент-связывающий иммуносорбентный метод исследования. Фермент-связывающий иммуносорбентный метод исследования (ELISA) можно использовать для количественного определения любых белков, включая гормоны. Этот метод сочетает специфичность, свойственную иммунологическому тестированию, с чувствительностью ферментного исследования. На рисунке ниже показаны основные элементы этого метода, который выполняют на пластиковом планшете с 96 ячейками.
Основные принципы фермент-связывающего иммуносорбентного метода исследования (ELISA) для определения концентрации гормона (Г).
АБ1 и АБ2 - антитела, «узнающие» гормон. АБ3 - антитело, «узнающее» АБ2.
Ф - фермент, связанный с АБ3, катализирующий образование окрашенного или флюоресцирующего продукта (П) из субстрата (С).
Количество продукта определяют с помощью оптических методов, оно пропорционально количеству гормона в ячейке при наличии в ней избытка антител
Каждая ячейка заполнена раствором с антителами (АБ), специфичными для определяемого гормона. В каждую ячейку добавляют пробы или стандартные растворы, затем — другие антитела (АБ2), которые также специфичны для гормона, но связываются с другим его участком реагирования. Третье антитело (АБ3) добавляют, чтобы узнать АБ2. В то же время оно связывается с ферментом, превращающим пригодный субстрат в продукт, который легко может быть определен колориметрическим или флюоресцентным оптическими методами.
Каждая молекула фермента катализирует образование многих тысяч молекул продукта, поэтому может быть обнаружено даже небольшое количество молекул гормона. По сравнению с методами конкурентного радиоиммунологического исследования при методе ELISA используют избыточное количество антител, поэтому все молекулы гормона захватываются в комплексы гормон-антитело. В связи с этим количество гормона, присутствующего в исследуемой пробе или стандартном растворе, пропорционально количеству образующегося продукта.
Метод ELISA нашел широкое применение в клинических лабораториях, поскольку:
(1) не требует применения радиоактивных изотопов;
(2) позволяет одновременно использовать 96 ячеек планшета и автоматизировать выполнение большого количества исследований;
(3) обеспечивает экономичное и точное определение концентрации гормонов.
Видео физиология гормонов щитовидной железы - профессор, д.м.н. П.Е. Умрюхин
