Физические методы инактивации вирусов. Гамма-лучи в инактивации вирусов.
Наиболее распространенными физическими методами инактивации вирусов являются гамма- и ультрафиолетовые (УФ) лучи.
Гамма-лучи — вид ионизирующего излучения, обладающий большой проникающей способностью. В основе действия их лежат два эффекта: прямое и непрямое воздействие. Первое заключается в непосредственном поглощении энергии излучения биологическими молекулами. Наиболее уязвимыми мишенями являются пуриновые и пиримидиновые основания. Непрямое действие — влияние на объект активных свободных радикалов Н, ОН, Н02 и молекулярных продуктов, например, перекиси водорода, образующихся в среде вследствие радиолиза воды. Перенос энергии радикалов в растворе осуществляется путем диффузии. Действие радикалов может вызвать такие изменения в ДНК, как дезаминирование оснований, дегидроксилирование, разрыв связей между дезоксирибозой и основанием, разрывы нуклеотидных цепей, окисление дезоксирибозы.
В результате реакций, происходящих под влиянием прямого и непрямого действия излучения, возможны различные повреждения структуры нуклеиновых кислот вирусов: разрыв водородных связей, появление сшивок, двухцепочечных разрывов. Белковая оболочка под воздействием радиации повреждается незначительно.
Инактивирующее действие гамма-лучей изучали на различных вирусах: осповакцины, болезни Ауески, простого герпеса, ящура, гриппа, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешенства, классической чумы свиней и др.
Установлено, что при воздействии гамма-лучей инфекционность вирусов теряется быстрее, чем антигенность. Так, при облучении вируса гриппа в дозе 30 кГр наблюдали полное разрушение инфекционности при сохранении гемагглютинирующей и нейраминидазной активности. Инфекционность вируса кори утрачивалась при дозе облучения 5 кГр, в то время как гемагглютинирующая активность — при 20 кГр. Гемагглютинирующая активность вирусов японского энцефалита, венесуэльского энцефаломиелита лошадей сохранялась в препаратах, в которых не обнаруживали инфекционный вирус при облучении в дозе 50—60 кГр. Аналогичную устойчивость к облучению обнаружил основной группоспецифический белок VP7 вируса катаральной лихорадки овец.
Инактивирующий эффект гамма-лучей зависит от влажности препарата, температуры, наличия защитных средств.
Установлено, что в водных растворах вирус инактивируется значительно быстрее, чем в сухих препаратах. Более высокая скорость инактивации вирусов в водных растворах по сравнению с сухими препаратами объясняется суммарным действием прямого и непрямого эффекта. При облучении вируса в сухих препаратах, ввиду отсутствия несвязанной воды, непрямое действие практически исключается. С повышением температуры при облучении возрастает радиочувствительность вируса, которую можно ослабить введением в среду различных веществ (гистидина, цистеина, альбумина, сыворотки, желатина и др.) Для инактивации вирусов Коксаки, гриппа и полиомиелита в среде Игла с 2% сыворотки требовалось увеличить дозу более чем в три раза по сравнению с облучением в воде.
Экспериментально доказана возможность применения гамма-лучей для приготовления антигенов и инактивированных вакцин против бешенства, гриппа, оспы, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, гепатита В и других инфекций. Применение гамма-излучения позволяет одновременно инактивировать и стерелизовать готовый препарат.
Эффективность УФ-лучей определяется их проницаемостью и адсорбцией биологическими молекулами. Белки поглощают УФ-лучи в меньшей степени, чем нуклеиновые кислоты, и поэтому более устойчивы к их действию.
Ультрафиолетовое облучение вызывает изменения структуры нуклеиновых кислот, заключающиеся в образовании димеров между соседними пиримидиновыми основаниями, а также ковалентных связей между нуклеиновой кислотой и белковой оболочкой. Повреждения ДНК приводят к инактивации вируса герпеса.
Вызывая глубокие изменения в структуре нуклеиновых кислот вирусов, УФ-лучи не оказывают существенного влияния на белковую оболочку, вследствие этого инактивированные вирусы способны сохранять свою антигенную и иммуногенную активность.
Однако такие особенности УФ-излучения как трудность выбора и контроля оптимальной дозы, обеспечивающей инактивацию вируса с сохранением антигенных свойств, а также эффекты экранирования и фотореактивации затрудняют практическое получение безопасных инактивированных препаратов.
Основной причиной, вызывающей инактивацию вируса при нагревании, является нарушение структурной целостности его генома, вызванное разрывом и образованием внутримолекулярных связей в нуклеиновой кислоте.
Инактивированная нагреванием вакцина против вирусной геморрагической болезни кроликов оказалась достаточно иммуногенной. Она вызывала устойчивость к экспериментальному заражению на 5-90-й день после однократного введения.
В процессе получения вакцины против гепатита В из плазмы крови вирусоносителей инактивацию вируса проводили в два этапа: полуфабрикат прогревали при 103°С в течение 90 секунд, а затем инактивированный сорбированный нафосфате алюминия антиген прогревали при 65°С в течение 10 ч. При таком способе происходила инактивация вируса гепатита и сопутствующих вирусов, которые могли присутствовать в донорской крови.
К простым и доступным методам инактивации вирусов относится фотодинамическое воздействие некоторых красителей, таких как метиленовая синька, акридиновый оранжевый, толуидин синий, нейтральный красный и другие, к которым чувствительны многие вирусы. Наиболее вероятный механизм такой инактивации — изменение или отщепление гуанина без разрыва полинуклеотидной цепи геномов. Фотодинамическую инактивацию применяли при изготовлении экспериментальных образцов инактивированных препаратов против клещевого энцефалита, краснухи, болезни Ауески, классической чумы свиней и других вирусов. Обработка вируса Сендай родамином-В, бриллиантовым зеленым и фиолетовым Гофмана сопровождалась частичной модификацией РНК без изменения капсидных белков. Инактивированный препарат обладал высокой иммуногенностью.
Основные показатели качества инактивированных препаратов, предназначенных для профилактической вакцинации, — безопасность и высокая иммуногенность.
При оценке качества ряда инактивированных препаратов первостепенное значение приобретает контроль авирулентности, направленный на выявление оставшихся жизнеспособных вирионов. Считается, что чем опаснее возбудитель, тем надежнее должны быть условия инактивации и методы контроля ее эффективности. Степень безопасности инактивированных вакцин находится в неразрывной связи с чувствительностью тест-системы, по которой оценивают полноту инактивации вируса. В связи с этим разработка наиболее чувствительных и совершенных методов обнаружения минимальных количеств живого вируса в инактивированных препаратах имеет большое значение. Следует иметь в виду, что, несмотря на стремление достичь полной инактивации вирусных частиц, всегда остается статистическая вероятность того, что какая-то часть из них может выдержать соответствующую обработку. Риск существования очень небольших количеств остаточного инфекционного вируса повышается по мере увеличения масштабов применения вакцины.
