Доимплантационная диагностика (ДД) — новое направление в ГТД наследственных болезней, возникшее в 90-х годах благодаря развитию методов вспомогательной репродукции (экстракорпорального оплодотворения), методов молекулярной цитогенетики (различные варианты FISH) и молекулярной генетики (варианты ПЦР), приемлемых для анализа генома единичных клеток. Если первые успешные попытки ДД были ограничены определением пола эмбриона при Х-сцепленных заболеваниях, то в настоящее время спектр наследственных болезней существенно увеличился и включает не только многие моногенные (муковисцидоз, фенилкетонурия), но и различные хромосомные болезни. Согласно последним данным, к 2001 г. в мире проведено около 2500 ДД. После отсева больных зародышей и трансплантации в матку реципиентов оставшихся эмбрионов в 500 случаях родились здоровые дети.
В России доимплантационная диагностика делает только первые шаги и по сути сосредоточена в нескольких центрах вспомогательных репродуктивных технологий в Москве и Санкт-Петербурге, причем и в этих центрах она ограничена диагностикой пола плода (планирование семьи и Х-сцепленные заболевания), а также исключением хромосомных аберраций.
Следует напомнить, что материалом для доимплантационной диагностики являются полярные тельца или отдельные бластомеры дробящейся яйцеклетки, полученные микрохирургическим путем от доимплантационных зародышей - продуктов экстракорпорального оплодотворения. В зависимости от материала ДД можно подразделить на преконцепционную (анализ полярных телец) и собственно доимплантационную (анализ бластомеров или клеток трофобласта). Кратко рассмотрим основные принципы ДД, возможности таких подходов, их преимущества и недостатки.
Диагностика с использованием полярных телец позволяет проводить отбор ооцитов, не несущих генных и геномных мутаций, для оплодотворения. Получены убедительные доказательства того, что удаление первого полярного тельца не нарушает процессов дробления и имплантации, а также не влияет на эмбриональное развитие. Полярные тельца чаще используют для диагностики моногенных болезней. Основная проблема — большая вероятность неточного прогноза о генотипе ооцита по результатам тестирования только первого полярного тельца. Вероятность попадания в ооцит второго порядка хромосомы, несущей мутацию в результате кроссинговера, теоретически составляет 50%, поэтому точный диагноз о наличии определенной мутации может быть поставлен только после окончания второго деления мейоза, т.е. по второму полярному тельцу, которое образуется уже после оплодотворения яйцеклетки.
Вторая проблема доимплантационной диагностики обусловлена особенностями применения молекулярно-генетических методов для диагностики единичной клетки. На результаты исследования могут повлиять различные факторы, в частности контаминация образца или условия проведения ПЦР.
Для преодоления этих проблем разработаны методы последовательного анализа 1 и 2 полярных телец при молекулярной диагностике аутосомно-рецессивных заболеваний. Достигнуты успехи и в разработке оптимальных условий для проведения ПЦР на единичных клетках, которые способствуют снижению вероятности ошибочного диагноза. Эти подходы позволяют успешно применять ДД в случаях Х-сцепленных, аутосомно-доминан-тных и рецессивных заболеваний.
Проблема цитогенетического анализа полярных телец заключается в невозможности применения традиционных методов исследования метафазных хромосом. Большинство работ выполнено FISH-методом с использованием смеси ДНК-зондов, специфичных к прицентромерным участкам отдельных хромосом.
В последние годы разработаны и апробированы методы приготовления хромосом из полярных телец человека, пригодные для стандартного цитогенетического анализа. Предложенные модификации уже позволили провести хромосомный анализ первых полярных телец с эффективностью 94,1%. Стали доступными для стандартного анализа и хромосомы второго полярного тельца после его инъекции в цитоплазму энуклеированного ооцита. Однако преодоление методических трудностей не решает проблему точности цитогенетическои диагностики по полярным тельцам. Так, анализ первого полярного тельца позволяет регистрировать анеуплоидию, возникшую вследствие аномальной сегрегации хромосом лишь в первом делении мейоза, в то время как частота анеуплоидных вторых полярных телец составляет около 25%. Более того, обнаружена высокая степень дискордантности хромосомных наборов во втором полярном тельце и в материнском пронуклеусе у мышей. Эти обстоятельства, обусловленные аномальной сегрегацией хроматид в анафазе II, ставят под сомнение корректность диагностики на основе анализа хромосом полярных телец. Таким образом, возможности для преконцепционной диагностики наследственных болезней уже реально существуют. Вместе с тем использование полярных телец для молекулярно-генетического и цитогенетического анализа пока еще не стало популярным среди специалистов ДД. Сложности методических приемов работы с единичными клетками и большая вероятность диагностических ошибок не оправдывают значительных финансовых затрат на проведение преконцепционной диагностики.
