Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в гематологии - возможности
Основу современной молекулярно-генетической методологии составляет полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая применяется в различных модификациях и обеспечивает эффективную амплификацию (многократное повторение) избранных последовательностей ДНК. Метод основан на правиле комплементарности: в процессе репликации матричной цепи напротив аденина в строящуюся комплементарную цепь всегда встраивается тимин, а напротив гуанина — цитозин. Любые другие нуклеотидные пары нарушают структуру ДНК и рассматриваются как мутации замены.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — циклический процесс, при котором в каждом цикле происходит удвоение числа тестируемых молекул ДНК. В ходе реакции исследуемую молекулу ДНК денатурируют (разделяют нагреванием до 94-95 °С на две комплементарные цепи) в присутствии набора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и избытка так называемых праймеров — синтетических ДНК-олигонуклеотидов длиной 20-30 нуклеотидов, которые соединяются с цепями ДНК. Один из праймеров комплементарен 5'-концу первой цепи ДНК, другой — 3'-концу второй цепи ДНК.
Два типа праймеров гибридизуются с комплементарными последовательностями каждой из двух противоположных цепей ДНК и выполняют роль «затравок» ферментативного синтеза. Добавляемый в реакционную смесь фермент (термостабильная ДНК-полимераза — Taq-полимераза бактерии Thermus aquaticus) достраивает каждый праймер до конца исходной цепи ДНК, которой он комплементарен. Бактерия Thermus aquaticus живет в воде при температуре 75 С.
Схема полимеразной цепной реакции.
Примечание: Taq - термостойкая ДНК-полимераза; длинные сплошные линии — исходные последовательности ДНК; короткие линии — праймеры; пунктирные линии — последовательности, синтезированные Taq-полимеразой, комплементарные исходным.
Температурный оптимум для Taq-полимеразы составляет 72 °С, но она остается стабильной и активной и при 94 °С. Недостатком Taq-полимеразы является большое количество ошибок в конечном продукте (10-4) вследствие того, что она лишена редактирующей 3'->5' экзонуклеазной активности. В настоящее время коммерчески доступны более точные и термостабильные ДНК-полимеразы из бактерий Thermococcus litoralis и Pyrococcus species. Конечный продукт реакции в виде двух новых двуцепочечных ДНК вновь денатурируют при повышенной температуре и повторяют цикл амплификации.
Процесс удвоения повторяется 20-30 раз, до получения миллионов копий исходной молекулы ДНК. Детекцию результатов ПЦР проводят в гель-электрофорезе (с окраской фракции ДНК бромистым этидием, ярко светящимся в ультрафиолетовом свете), так как полученные фрагменты ДНК отличаются по размерам и/или нуклеотидной последовательности и, соответственно, электрофоретической подвижности. Таким образом, происходит избирательное (лимитированное нуклеотидными последовательностями праймеров) умножение специфических участков ДНК до концентрации, при которой они могут быть легко обнаружены и проанализированы.
Продолжительность каждого из трех этапов амплификации (денатурация ДНК, связывание с нею праймеров и репликация), температура и другие условия, при которых они происходят, подбираются индивидуально для каждого конкретного случая. Число циклов зависит от цели исследования.
Во избежание ложноположительных результатов ПЦР-анализа следует принимать меры по предотвращению перекрестной контаминации анализируемого материала, например попадания в него ДНК, заведомо содержащей искомую мутацию, используемой в качестве позитивного контроля. Чтобы избежать ложноотрицательных результатов, реакцию проводят и с другими генами, которые являются тканеспецифичными для данного образца.
Для количественного анализа генной экспрессии используется вариант ПЦР, который называется РТ-ПЦР (ретротранскриптазная ПЦР), в которой вместо геномной ДНК амплифицируют кДНК (комплементарную ДНК), синтезированную на РНК-матрице с помощью вирусного фермента обратной транскриптазы.
Для визуализации продуктов амплификации наилучшие результаты дает метод Southern blotting, который назван по имени его автора Е. М. Southern и применяется для различных целей. Фрагменты, полученные при ПЦР-амплификации или разрезании геномной ДНК рестриктазами, разделяют по размеру гель-электрофорезом. Затем гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану и промывают буферным раствором по направлению к фильтру. При этом фрагменты ДНК переносятся на фильтр, где остается их отпечаток — «реплика». Фильтр с ДНК-репликами инкубируют в емкости со смесью индикаторных олигонуклеотидных зондов, комплементарных анализируемым последовательностям.
С этой целью обычно используют меченные радиоактивным фосфором или флюоресцентной меткой олигонуклеотидные зонды, которые в процессе инкубации гибридизуются с комплементарными им фрагментами ДНК на фильтре. После гибридизации на фильтр накладывают рентгеновскую пленку. На проявленной пленке остаются отпечатки в виде темных полос, по которым определяют количество и размер фрагментов ДНК, комплементарных соответствующим зондам. Если по такой же схеме анализируют РНК или белок, то соответствующие модификации называются Northern и Western blotting.
Видео методика и принципы ПЦР (полимеразной цепной реакции) в диагностике
