Гематология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Гематология:
Гематология
Физиология крови
Методы исследования
Анемии
Острые лейкозы
Миелодиспластические синдромы (МДС)
Хронические лейкозы
Лимфомы
Гистиоцитозы - гистиоцитоз Х
Макроглобулинемии
Коагулопатия
Патология тромбоцитов
Переливание крови
Трансплантация стволовых клеток
Книги по гематологии
Иностранные книги по гематологии
Рекомендуем:
Остальные разделы:
Абдоминальная хирургия
Анатомия человека
Акушерство
Биология
Генетика
Гепатология
Гигиена труда
Гинекология
Гистология
Дерматология
Оз и Оз
Кардиология
Лучевая медицина
Микробиология
Неврология
Неотложная хирургия
Отоларингология
Офтальмология
Профилактика заболеваний
Психология
Пульмонология
Физиология человека
Скорая помощь
Стоматология
Топографическая анатомия
Травматология
Фармакология
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в гематологии - возможности

Основу современной молекулярно-генетической методологии составляет полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая применяется в различных модификациях и обеспечивает эффективную амплификацию (многократное повторение) избранных последовательностей ДНК. Метод основан на правиле комплементарности: в процессе репликации матричной цепи напротив аденина в строящуюся комплементарную цепь всегда встраивается тимин, а напротив гуанина — цитозин. Любые другие нуклеотидные пары нарушают структуру ДНК и рассматриваются как мутации замены.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — циклический процесс, при котором в каждом цикле происходит удвоение числа тестируемых молекул ДНК. В ходе реакции исследуемую молекулу ДНК денатурируют (разделяют нагреванием до 94-95 °С на две комплементарные цепи) в присутствии набора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и избытка так называемых праймеров — синтетических ДНК-олигонуклеотидов длиной 20-30 нуклеотидов, которые соединяются с цепями ДНК. Один из праймеров комплементарен 5'-концу первой цепи ДНК, другой — 3'-концу второй цепи ДНК.

Два типа праймеров гибридизуются с комплементарными последовательностями каждой из двух противоположных цепей ДНК и выполняют роль «затравок» ферментативного синтеза. Добавляемый в реакционную смесь фермент (термостабильная ДНК-полимераза — Taq-полимераза бактерии Thermus aquaticus) достраивает каждый праймер до конца исходной цепи ДНК, которой он комплементарен. Бактерия Thermus aquaticus живет в воде при температуре 75 С.

полимеразная цепная реакция
Схема полимеразной цепной реакции.
Примечание: Taq - термостойкая ДНК-полимераза; длинные сплошные линии — исходные последовательности ДНК; короткие линии — праймеры; пунктирные линии — последовательности, синтезированные Taq-полимеразой, комплементарные исходным.

Температурный оптимум для Taq-полимеразы составляет 72 °С, но она остается стабильной и активной и при 94 °С. Недостатком Taq-полимеразы является большое количество ошибок в конечном продукте (10-4) вследствие того, что она лишена редактирующей 3'->5' экзонуклеазной активности. В настоящее время коммерчески доступны более точные и термостабильные ДНК-полимеразы из бактерий Thermococcus litoralis и Pyrococcus species. Конечный продукт реакции в виде двух новых двуцепочечных ДНК вновь денатурируют при повышенной температуре и повторяют цикл амплификации.

Процесс удвоения повторяется 20-30 раз, до получения миллионов копий исходной молекулы ДНК. Детекцию результатов ПЦР проводят в гель-электрофорезе (с окраской фракции ДНК бромистым этидием, ярко светящимся в ультрафиолетовом свете), так как полученные фрагменты ДНК отличаются по размерам и/или нуклеотидной последовательности и, соответственно, электрофоретической подвижности. Таким образом, происходит избирательное (лимитированное нуклеотидными последовательностями праймеров) умножение специфических участков ДНК до концентрации, при которой они могут быть легко обнаружены и проанализированы.

Продолжительность каждого из трех этапов амплификации (денатурация ДНК, связывание с нею праймеров и репликация), температура и другие условия, при которых они происходят, подбираются индивидуально для каждого конкретного случая. Число циклов зависит от цели исследования.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Во избежание ложноположительных результатов ПЦР-анализа следует принимать меры по предотвращению перекрестной контаминации анализируемого материала, например попадания в него ДНК, заведомо содержащей искомую мутацию, используемой в качестве позитивного контроля. Чтобы избежать ложноотрицательных результатов, реакцию проводят и с другими генами, которые являются тканеспецифичными для данного образца.

Для количественного анализа генной экспрессии используется вариант ПЦР, который называется РТ-ПЦР (ретротранскриптазная ПЦР), в которой вместо геномной ДНК амплифицируют кДНК (комплементарную ДНК), синтезированную на РНК-матрице с помощью вирусного фермента обратной транскриптазы.

Для визуализации продуктов амплификации наилучшие результаты дает метод Southern blotting, который назван по имени его автора Е. М. Southern и применяется для различных целей. Фрагменты, полученные при ПЦР-амплификации или разрезании геномной ДНК рестриктазами, разделяют по размеру гель-электрофорезом. Затем гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану и промывают буферным раствором по направлению к фильтру. При этом фрагменты ДНК переносятся на фильтр, где остается их отпечаток — «реплика». Фильтр с ДНК-репликами инкубируют в емкости со смесью индикаторных олигонуклеотидных зондов, комплементарных анализируемым последовательностям.

С этой целью обычно используют меченные радиоактивным фосфором или флюоресцентной меткой олигонуклеотидные зонды, которые в процессе инкубации гибридизуются с комплементарными им фрагментами ДНК на фильтре. После гибридизации на фильтр накладывают рентгеновскую пленку. На проявленной пленке остаются отпечатки в виде темных полос, по которым определяют количество и размер фрагментов ДНК, комплементарных соответствующим зондам. Если по такой же схеме анализируют РНК или белок, то соответствующие модификации называются Northern и Western blotting.

- Читать далее "Методы детекции точечных мутаций в гематологии - возможности"


Оглавление темы "Методы исследования в гематологии":
  1. Уровень железа в крови норме. Исследование обмена железа
  2. Осмотическая резистентность эритроцитов в норме. Биохимические исследования в гематологии
  3. Миелограмма в норме - цитология исследования костного мозга
  4. Гистологические исследования в гематологии. Показания к трепанобиопсии
  5. Цитогенетические исследования в гематологии: окрашивание хромосом, метод FISH
  6. Кариотипирование в гематологии. Классификация хромосом
  7. Хромосомные аномалии в гематологии - классификация
  8. Молекулярно-генетические исследования в гематологии - возможности
  9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в гематологии - возможности
  10. Методы детекции точечных мутаций в гематологии - возможности
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта