Методы детекции точечных мутаций в гематологии - возможности
Под точечными мутациями понимают замены, вставки или делеции одного-двух нуклеотидов. В клинической диагностике чаще проводят поиск уже известных мутаций. К наиболее распространенным методам обнаружения известных точечных мутаций относятся:
— анализ рестрикционных фрагментов,
— гибридизация с аллелеспецифическими олигонуклеотидами,
— аллелеспецифическая амплификация.
Первые два метода подразумевают выявление мутаций в предварительно ПЦР-амплифицированном участке ДНК.
Анализ рестрикционных фрагментов основан на расщеплении ДНК рестриктазами — ферментами, распознающими определенные короткие (в несколько нуклеотидов) последовательности и специфически расщепляющими их. Мутации, изменяющие последовательность нуклеотидов, приводят к исчезновению или появлению новых сайтов рестрикции и, соответственно, к изменению длины рестрикционных фрагментов.
Аллельные вариации, характеризующиеся измененной картиной гидролиза (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), выявляются при анализе расщепленных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза, так как фрагменты разной длины имеют различную электрофоретическую подвижность. Анализ рестрикционных фрагментов позволяет обнаружить одну мутантную клетку в присутствии 50-100 нормальных.
Разрешающая способность метода может быть значительно повышена благодаря модификации, когда один из праймеров для ПЦР комплементарен последовательности ДНК в непосредственной близости к мутации и содержит сайт рестрикции, так что синтезированный в процессе амплификации фрагмент нормальной ДНК получает заложенный в праймере сайт рестрикции, а фрагмент мутантной ДНК — нет.
После первого цикла амплификации продукт репликации нормальной ДНК расщепляют рестриктазой, и во втором цикле амплифицируется только мутантный аллель. Применение модификации делает возможной детекцию одной мутантной копии гена в присутствии 106 нормальных.
Гибридизация с аллелеспецифическими олигонуклеотидами. Появление в результате точечной мутации некомплементарного (неспаренного) нуклеотида снижает температуру плавления двуцепочечной ДНК. Максимальное снижение этого параметра на 5-7 °С, достижимое при длине двойной спирали ДНК 20 пар нуклеотидов, достаточно для специфической детекции однонуклеотидных замен в исследуемой ДНК гибридизацией с комплементарным данному участку олигонуклеотидом (зондом).
Использование для гибридизации олигонуклеотидных зондов большей длины уменьшает разницу температур плавления, обусловленную появлением неспаренного нуклеотида. Условия гибридизации индивидуальны и подбираются эмпирически для каждой анализируемой последовательности ДНК.
Аллелеспецифическая амплификация проводится в двух параллельных ПЦР, которые являются частью системы детекции. В клетке транскрипция ДНК идет в направлении 5'->3'. В одной реакции 5'-праймер комплементарен последовательности нормальной ДНК, в другой — мутантной. Условия ПЦР подбираются так, что амплификация происходит только в случае полной комплементарности последовательности праймера и исследуемого фрагмента гена.
Таким образом, амплифицируется только один аллель — либо нормальный, либо мутантный. Гетерозиготное и гомозиготное состояния можно отличить, проводя параллельные ПЦР с праймерами, отличающимися флюоресцентными метками.
Любой из этих методов применим для анализа аллельных различий в клинической практике и пригоден для детекции всех нуклеотидных замен. Детекция результатов проводится в гель-электрофорезе ПЦР-продуктов. Все эти методы допускают стандартизацию и автоматизацию. В сомнительных случаях анализ следует повторить и его результат подтвердить секвенированием (установлением нуклеотидной последовательности) продуктов амплификации.