Гематология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Гематология:
Гематология
Физиология крови
Методы исследования
Анемии
Острые лейкозы
Миелодиспластические синдромы (МДС)
Хронические лейкозы
Лимфомы
Гистиоцитозы - гистиоцитоз Х
Макроглобулинемии
Коагулопатия
Патология тромбоцитов
Переливание крови
Трансплантация стволовых клеток
Книги по гематологии
Иностранные книги по гематологии
Рекомендуем:
Остальные разделы:
Абдоминальная хирургия
Анатомия человека
Акушерство
Биология
Генетика
Гепатология
Гигиена труда
Гинекология
Гистология
Дерматология
Оз и Оз
Кардиология
Лучевая медицина
Микробиология
Неврология
Неотложная хирургия
Отоларингология
Офтальмология
Профилактика заболеваний
Психология
Пульмонология
Физиология человека
Скорая помощь
Стоматология
Топографическая анатомия
Травматология
Фармакология
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Методы детекции точечных мутаций в гематологии - возможности

Под точечными мутациями понимают замены, вставки или делеции одного-двух нуклеотидов. В клинической диагностике чаще проводят поиск уже известных мутаций. К наиболее распространенным методам обнаружения известных точечных мутаций относятся:
— анализ рестрикционных фрагментов,
— гибридизация с аллелеспецифическими олигонуклеотидами,
— аллелеспецифическая амплификация.

Первые два метода подразумевают выявление мутаций в предварительно ПЦР-амплифицированном участке ДНК.

Анализ рестрикционных фрагментов основан на расщеплении ДНК рестриктазами — ферментами, распознающими определенные короткие (в несколько нуклеотидов) последовательности и специфически расщепляющими их. Мутации, изменяющие последовательность нуклеотидов, приводят к исчезновению или появлению новых сайтов рестрикции и, соответственно, к изменению длины рестрикционных фрагментов.

Аллельные вариации, характеризующиеся измененной картиной гидролиза (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), выявляются при анализе расщепленных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза, так как фрагменты разной длины имеют различную электрофоретическую подвижность. Анализ рестрикционных фрагментов позволяет обнаружить одну мутантную клетку в присутствии 50-100 нормальных.

методы детекции точечных мутаций

Разрешающая способность метода может быть значительно повышена благодаря модификации, когда один из праймеров для ПЦР комплементарен последовательности ДНК в непосредственной близости к мутации и содержит сайт рестрикции, так что синтезированный в процессе амплификации фрагмент нормальной ДНК получает заложенный в праймере сайт рестрикции, а фрагмент мутантной ДНК — нет.

После первого цикла амплификации продукт репликации нормальной ДНК расщепляют рестриктазой, и во втором цикле амплифицируется только мутантный аллель. Применение модификации делает возможной детекцию одной мутантной копии гена в присутствии 106 нормальных.

Гибридизация с аллелеспецифическими олигонуклеотидами. Появление в результате точечной мутации некомплементарного (неспаренного) нуклеотида снижает температуру плавления двуцепочечной ДНК. Максимальное снижение этого параметра на 5-7 °С, достижимое при длине двойной спирали ДНК 20 пар нуклеотидов, достаточно для специфической детекции однонуклеотидных замен в исследуемой ДНК гибридизацией с комплементарным данному участку олигонуклеотидом (зондом).

Использование для гибридизации олигонуклеотидных зондов большей длины уменьшает разницу температур плавления, обусловленную появлением неспаренного нуклеотида. Условия гибридизации индивидуальны и подбираются эмпирически для каждой анализируемой последовательности ДНК.

Аллелеспецифическая амплификация проводится в двух параллельных ПЦР, которые являются частью системы детекции. В клетке транскрипция ДНК идет в направлении 5'->3'. В одной реакции 5'-праймер комплементарен последовательности нормальной ДНК, в другой — мутантной. Условия ПЦР подбираются так, что амплификация происходит только в случае полной комплементарности последовательности праймера и исследуемого фрагмента гена.

Таким образом, амплифицируется только один аллель — либо нормальный, либо мутантный. Гетерозиготное и гомозиготное состояния можно отличить, проводя параллельные ПЦР с праймерами, отличающимися флюоресцентными метками.

Любой из этих методов применим для анализа аллельных различий в клинической практике и пригоден для детекции всех нуклеотидных замен. Детекция результатов проводится в гель-электрофорезе ПЦР-продуктов. Все эти методы допускают стандартизацию и автоматизацию. В сомнительных случаях анализ следует повторить и его результат подтвердить секвенированием (установлением нуклеотидной последовательности) продуктов амплификации.

- Вернуться в раздел "гематология"


Оглавление темы "Методы исследования в гематологии":
  1. Уровень железа в крови норме. Исследование обмена железа
  2. Осмотическая резистентность эритроцитов в норме. Биохимические исследования в гематологии
  3. Миелограмма в норме - цитология исследования костного мозга
  4. Гистологические исследования в гематологии. Показания к трепанобиопсии
  5. Цитогенетические исследования в гематологии: окрашивание хромосом, метод FISH
  6. Кариотипирование в гематологии. Классификация хромосом
  7. Хромосомные аномалии в гематологии - классификация
  8. Молекулярно-генетические исследования в гематологии - возможности
  9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в гематологии - возможности
  10. Методы детекции точечных мутаций в гематологии - возможности
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта