Реагенты для исследования гемостаза:
1. Оксалат натрия (Na2О4C2) 0,1 М раствора приготовляется из 1,34 г вещества pro analisl на 100 мл дистилированной воды.
2. Трехнатриевый цитрат (C6H5О7Nag) 0,1 М раствора — из кристаллизованного двумя молекулами Н2О вещества использовать 3 г на 100 мл дистилированной воды; когда кристаллизация проводится 5 молекулами Н20 применить 3,5 г вещества на 100 мл дистилированной воды, а если кристаллизация осуществляется 5,5 молекулами Н20 применить 3,6 г на 100 мл дистилированной воды.
3. Хлорид кальция 0,025 М раствора, полезный при всех сппсобах исследования гемостаза. Приготовление следующее: 0,365 г СаС12 с 2 Н20 (или 30% воды) растворить в 100 мл дистилированной воды. Раствор можно хранить примерно месяц при температуре + 4°С. При желании хранить раствор более продолжительный срок его концентрация должна быть в 4 раза больше, при этом температура та же (+4°С) но хранение осуществляется разделением раствора на малые доли, которые свеже разводить дистилированной водой до рабочей концентрации. Помутнелый раствор выбросить.
4. Физиологический раствор (ФР) получим разведением 8,5 г NaCl в 1000 мл дистилированной воды.
5. Буфер Michaelis, показатель водорода 7,35 получим, размешав 55,40 мл 2,06% мединала, 44,6 мл 0,1 Н NaCl и 50 мл дистилированной воды.
6. Буфер борат, показатель водорода 9 (±0,1) получим растворив 9 г NaCl и 1 г бората натрия в 1000 мл дистилированной воды.
7. Буфер имидазол, показатель водорода 7,3. В 50 мл дистилированной воды растворить, в отмеченной последовательности: 0,34 г (СН:СН. B:CH.NH) (глиоксалин) и 0,585 г NaCl; добавить 18,6 мл 0,1 Н NaCl и долить дистилированной воды до количества 100 мл.
8. Забуференный физиологический раствор содержит 9 частей ФР 1 часть имидазола (1,36 г имидазола на 1000 мл дистилированной воды).
9. Раствор чистого фибриногена 1000 мг/100 мл буфера имидазол (реагент для определения АТIII). Применять в свеж приготовленном виде.
10. Раствор тромбина для PC содержит 50 Ед/мл дистилированной воды.
11. Раствор тромбина для ВТр содержит 5 Ед/мл дистилированной воды.
12. Раствор тромбина для определения АТIII по 20 Ед/мл.
13. Взвесь каолина приготовляется из 0,5 г каолина и 100 мл забуференного ФР.
14. Раствор гепарина : 10 Ед/мл (1 Ед/0,1 мл) и 5 Ед/мл (0,5 Ед/ 0,1 мл).
Реагенты 1—14 хранить в холодильнике, при температуре +4°С. В случае явной порчи (помутнение, выпадение, образование клочьев) выбросить и заменить свежеприготовленным реагентом.
15. Раствор 0,1 Н НС1. Для получения разбавить 0,84 мл НС1 — плотностью 1,19 — в 100 мл дистилированной воды.
16. Раствор 5 М мочевины получим разбавлением 300 г мочевины в 1000 мл дистилированной воды.
18. Богатая тромбоцитами плазма получим 5-минутным центрифугированием отобранной пробы крови со скоростью 1000 об./мин. Применяется для определения ВГ, PC.
19. Бедная тромбоцитами плазма получим 5-минутным центрифугированием отобранной пробы крови пли богатой тромбоцитами плазмы, при 5000 об./мин. Применяется для в:ех остальных определений плазматических факторов.
20. Адсорбировннная плазма. Приготовление следующее: перемешать 1 мл свежей плазмы, с небольшим содержанием тромбоцитов, со 100 мг BaS04; 20 мин. энергично мешать палочкой, при комнатной температуре; полчаса процентрифугировать со скоростью 4000 об./мин. Применяется надосадочная масса, содержащая факторы I, V, VIII, XI, XII, XIII но лишенная факторов II, VII, IX, X.
Используется для определения активности ФИ, определения ТРП и ТОТ, также факторов II + VII + + X. ВК этой плазмы должно превышать 3 мин.
21. Плазма, лишенная факторов VII + X. Приготовление: профильтровать щавелевокислую плазму человека (лучше крупного рогатого скота) с помощью 20% азбестового фильтра, затем второй раз — через 30% филльтр (Е.К. Seitz). Применяется для определения проконвертина (F. Stuart-Prower), В К (время Квика) этой плазмы должен укладываться в пределы от 60 до 80 сек.
22. Плазма, лишенная фактора V. Получим хранением щавелевокислой плазмы человека 7—15 дней, в закупоренной, ватной пробкой посуде, при температуре +4°С. Отдельные авторы утверждают, что то же достигается за 24—48 ч. при 37°С. ВК этой плазмы больше 50 сек. Применяется для определения Ф-V.
23. Старая сыворотка: отобрать кровь, как при определении ТРП. После свертывания и ретракции осветлить сыворотку и продержать сутки в комнатной температуре.
Продукт контакта (Biggs-Nossel). В пробирке для центрифуги перемешать 1 мл целлита 512 (100 мг/мл ФР) и 2 мл плазмы, с малым содержанием тромбоцитов. Подвергнуть 20-минутному процессу инкубации в ванне, при +37СС, при этом энергично и непрерывно мешать. Процентрифугировать 5 мин. при 3000 об./мин. Бережно устранить надосадочную массу а осевший целлит подвергнуть ресуспендированию в 1 мл ФР.
Снова процентрифугировать 5 мин. со скоростью 3000 об./мин., удалить надосадочную массу и промывать физиологическим раствором после 5 часов. Последнее ресурспендирование целлита сделать в 1 мл 10% раствора NaCl. Микстуру подвергнуть инкубации при +37°С, при этом все время встряхивать. Процентрифугировать 5 мин. при 3000 об./мин. Отобрать надосадочную массу, 12 часов продиализировать по сравнению с одним объемом дистилированной воды, равняющимся 10 обыемам элюата.
Элюированный диализат разделить на небольшие количества и хранить при температуре —20°С. До использования разбавить физиологическим раствором из расчета 1:20.
Для сохранения полноценной активности описанных выше биологических реагентов держать их в рефрижераторе, при температуре от —20° до —40°С, притом малыми порциями, каждая из них расчитанная на потребности одного рабочего дня.
