Технология получения рекомбинантной ДНК была разработана в 1970-х гг., поскольку возникла необходимость в значительных количествах ДНK для проведения биохимических исследований. Метод заключается в вырезании определенного сегмента из молекулы ДНК с помощью специфических ферментов эндонуклеаз, называемых рестрикционными ферментами; вырезанный сегмент затем можно ввести в любой вектор. Такой подход позволяет копировать участок ДНК миллион раз.
Успехи в разработке технологии получения рекомбинантной ДНК обеспечили существенный прорыв в молекулярной биологии за последние 30 лет. Большинство методов нашло широкое применение в научно-исследовательских лабораториях. Эти подходы используют в рутинной практике для анализа структуры, экспрессии и организации генов; изучения путей регуляции, согласно которым клетки контролируют экспрессию генов; открытия новых генов и способов лечения.
Эти успехи изменили характер медицинских исследований. Генная инженерия, когда организм модифицируют путем включения в него новых генов с заданными свойствами, становится рутинной практикой во многих научно-исследовательских лабораториях. Методы получения рекомбинантной ДНК применяют для массовой продукции белков, используемых в качестве лекарственных препаратов, таких как рекомбипантный ТАП.
Возможность манипуляций с геномом человека открыла новые перспективы для развития диагностических тестов и новых лекарственных препаратов. Методы молекулярной биологии, как и структура самой ДНК, на удивление просты. В этой статье описаны основные подходы; для непосредственного изучения методик рекомендуем читателям исчерпывающие обзоры.
Клонирование ДНК
Молекулярное клонирование — способ получения миллионов копий определенной последовательности ДНК или гена внутри бактериальной клетки. Сначала фрагмент ДНК помещают в вектор для клонирования. В качестве векторов чаще всего используют небольшие кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами, или бактериальные вирусы, называемые фагами. Векторы содержат генетическую информацию, что позволяет бактериальной клетке реплицировать последовательность ДНК. После внедрения фрагмента ДНК плазмиду или фаг вводят в бактериальную клетку.
Размножающиеся в культуре бактерии реплицируют вектор, содержащий требуемую последовательность ДНК, в количестве сотен копий на клетку, позволяя получить множество идентичных копий исходной последовательности ДНК. Затем векторы извлекают из культуры бактериальных клеток с помощью тех же рестрикционных ферментов, которые были использованы для включения фрагмента ДНК в вектор.
Молекулярные биологи используют полученные из бактерии рестрикционные эндонуклеазы в качестве молекулярных ножниц, вырезающих участки молекул ДНК с прогнозируемой последовательностью. Каждый рестрикционный фермент распознает специфическую последовательность нуклеотидов.
Эти области распознавания расположены вдоль молекулы ДНК любого организма случайным образом и состоят из короткого симметричного мотива (характерная последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах или аминокислот в пол и пептидах, часто выполняющая определенные функции), называемого палиндромом, который одинаково прочитывается в противоположных направлениях на обеих цепях двойной спирали ДНК. Например, фермент EcoRI из бактерии Escherichia coli распознает и отрезает последовательность GAATTC в двухцепочечной ДНК в местах стыка GA и AG.
В большинстве случаев рестрикционные ферменты разрезают палиндромную последовательность асимметрично, оставляя одноцепочечный хвост с каждого конца разреза. Эти так называемые липкие концы содержат уникальные комплементарные последовательности, которые могут быть использованы для спаривания фрагмента человеческой ДНК с комплементарной последовательностью ДНК из другого источника. В ходе ферментативной реакции непрерывные двухцепочечные ДНК соединяются, образуя гладкую стыковку. Такие подходы используют при конструировании различных изменений в молекуле ДНК для разных целей, включая клонирование генов, выведение мышей с выбитым геном или разработку стратегии лечения, основанной на использовании рекомбинантной ДНК.
