Исследование реактивности иммуноглобулинов. Метод спин-меченых гаптенов
Хсиа и Литтл (Hsia, Little, 1973) исследовали взаимодействие двух спин-меченых гаптенов — ДНФ-гидразонового производного N-1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-пирролидона (I) и М-1-(оксил-2,2,5,5-тетраметил-3-метиламинопирролидинил)2,4-динитробензола (II) с двумя мисломными IgA — МОРС 315 и 460 как методом ЭПР, так и по уменьшению квантового выхода флуоресценции белка.
Обнаружено, что при связывании гаптенов I и II белком МОРС 315 N—О-группы в обоих случаях находятся в сильно иммобилизированном состоянии, но в спектре ЭПР соединения II в отличие от спектра соединения I наблюдаются два типа иммобилизованных компонент. При связывании с белком МОРС 460 свобода вращения N—О-группы соединения I также значительно ограничена, в то время как на вращение N—О-группы соединения II связывание с этим белком влияет мало.
Однако, судя по близкому уменьшению квантового выхода флуоресценции белков при связывании спин-меченых гаптенов и по результатам исследования термодинамики этого процесса, сродство соединений I и II к белкам МОРС 315 и 460 различается незначительно. Следовательно, степень иммобилизации N—О-группы спин-меченого гаптена не во всех случаях характеризует прочность комплекса.
По мнению авторов, различия в иммобилизации соединений I и II могут вызываться двумя причинами: 1) лиганды связываются в различных участках конформационно жесткого активного центра, 2) конформация активного центра может стабилизироваться в той или иной степени в зависимости от различий в структуре лигандов.
В другой работе исследовались причины, вызывающие появление двух типов иммобилизованных компонент в спектре ЭПР комплекса II с белком МОРС 315. Было показано, что оно обусловлено двумя энантомерными формами спин-меченого гаптена II. Группа N—О одной из форм лиганда при этом попадает в менее гидрофобное микроокружение, а второй — в более гидрофобное, что обусловливает различное положение иммобилизованных компонент на оси напряженности магнитного поля. Связывание разделенных энантомерных форм (спин-меченых аминов — ДНФ) белком МОРС 315 (приводило к появлению только одного типа компонент.
Метод спин-меченых гаптенов
Замещение спин-меченых гаптенов в активных центрах антител гомологичными гаптена ми было использовано Леутом и сотрудниками (Leute е. а., 1972) для определения концентрации морфина в исследуемом растворе. В этом методе использовался эффект сильного увеличения высоты линий спектра ЭПР спин-меченого морфина при его переходе из иммобилизованного состояния в свободное в результате вытеснения из активного центра. Высота узких линий расторможенного спектра ЭПР характеризует в данном случае концентрацию морфина в исследуемом растворе.
Нижний предел чувствительности такого метода—10 7М морфина (0,03 мкг/мл). В дальнейшем этот подход получил развитие (Montgomery е. а., 1975) и был применен для определения концентрации ряда лекарственных веществ в сыворотке. Он оказался в 100 (раз чувствительнее обычного химического метода и обладал высокой специфичностью. Для одного определения достаточно 50 мкл сыворотки.
Хсиа и сотрудники использовали комплекс ДНФ — метилен (N-1-оксил-2,2,5,5,-тетраметил-3-метил, аминопирролидинил-2,4-динитробензол) с миеломным иммуноглобулином А (МОРС 315) как модельную систему для исследования перекрестной активности этого белка по отношению к ДПФ и его аналогам. О количестве свободного, вытесненного из активных центров спин-меченого гаптена судили по интенсивности высокополыюй компоненты спектра ЭПР. Количественные оценки, полученные этим методом, находятся в хорошем соответствии с результатами равновесного диализа. Предложенный метод является весьма перспективным в иммунохимических исследованиях.
На основании полученных данных можно сделать следующие выводы о строении активного центра антител.
