Особенности химических методов инактивации вирусов. Принципы химической инактивации.
В опытах с герпесвирусом типа I крупного рогатого скота установлено, что в процессе инактивации формальдегидом эпитопы гликопротеинов g I, g II и g IV на 80% теряют способность связывать соответствующие моноклональные антитела. Однако это не коррелировало с их способностью вызывать антительный ответ. Инактивация формальдегидом энтеровирусов не влияла на распознавание группоспецифического антигена Т клетками. В изготовлении инактивированных вакцин, кроме формальдегида, нашел применение глютаровый альдегид. Он вызывает агрегацию вирионов благодаря образованию межмолекулярных связей в результате взаимодействия формальдегида с аминогруппами поверхностных белков вирионов. При сшивке белковых молекул альдегидом блокируется до 2/3 остатков лизина. Инактивация глютаральдегидом не сопровождается заметным снижением антигенных свойств вирусов, вероятно, благодаря полимеризации белковых молекул.
Бета-пропиолактон представляет собой высокоактивный алкилирующий агент, нестойкий в водных растворах и легко гидролизуемый с образованием безвредных веществ: гидроакриловой и бета-оксипропионовой кислот. В связи с этим отпадает необходимость в нейтрализации избытка бета-пропиолактона и продуктов его распада.
Бета-пропиолактон оказывает инактивирующее действие на многие вирусы. При оптимальной концентрации бета-пропиолактона снижается инфекционность вируса ньюкаслской болезни без существенного изменения гемагглютинирующей, нейраминидазной и гемолизирующей активности. Бета-пропиолактон разрушает инфекционность вируса Сендай, не влияя на его антигенные свойства. Высказано предположение, что потеря инфекционности вирусами Сендай и ньюкаслской болезни обусловлена взаимодействием бета-пропиолактона с вирусным геномом. С помощью бета-пропиолактона удалось получить высокоактивные вакцины против бешенства и неинфекционные антигенноактивные препараты вируса катаральной лихорадки овец, а также инфекционного бронхита птиц.
Инактивация вирусов бета-пропиолактоном зависит от концентрации инактиватора, температуры взаимодействия и содержания белка в вирусной суспензии. Повышение концентрации бета-пропиолактона может привести к нежелательной реакции с вирусными белками и, вследствие этого, к снижению антигенной активности.
Из других химических веществ для инактивации вирусов представляет интерес гидроксиламин, который, как и бета-пропиолактон, полностью разлагается в течение короткого периода. Инактивирующее действие гидроксиламина определяется его взаимодействием с пиримидиновыми основаниями нуклеиновой кислоты, зависящим от величины рН. В слабокислой среде происходит, главным образом, изменение цитозина, а в щелочной — урацила. Обработка некоторых вирусов (полиомиелита, бешенства, западного и восточного энцефаломиелита лошадей, гриппа, ньюкаслской болезни, осповакцины и др.) гидроксиламином при оптимальном режиме инактивации не приводила к существенным изменениям их антигенной активности, что позволило использовать это вещество для изготовления диагностических антигенов и инактивированных вакцин.
В последние годы внимание исследователей привлекли азиридины, и особенно этиленимин и его производные. Этиленимин - насыщенное, гетероциклическое соединение, впервые было синтезировано из бромэтиламина в 1988 г.. Этиленимин, как и другие азиридины, относится к группе высокореакционных алкилирующих соединений, обладающих токсичностью.
Этиленимин и его производные оказывают сильное инактивирующее действие на вирусы, сохраняя их антигенные свойства. Инактивирующий эффект этиленимина на вирусы, по-видимому, объясняется депуринизацией и последующей деполимеризацией нуклеиновых кислот. Замена формальдегида этиленимином основывалась на следующих преимуществах. В отличие от формальдегида, вызывающего образование поперечных связей в вирусных белках, этиленимин оказывал влияние только на нуклеиновую кислоту. При 25°С инактивация вируса представляла собой быстрый, легко контролируемый линейный процесс, а полученные при этом полностью неинфекционные антигены оказались удобными в дальнейшей переработке — концентрировании и очистке.
Изучение кинетики инактивации вируса леса Семлики ацетилэтиленимином показало возрастание скорости инактивации с увеличением температуры (до 40°С) и концентрации инактиватора (до 0,1%). Оптимальной оказалась температура 37°С, так как при ее снижении ниже 23°С вирус полностью не инактивировался, а при повышении — происходила термоинактивация вируса и потеря протективных свойств. Отмечена перспективность применения ацетилэтиленимина для приготовления инактивированных вакцин против тогавирусов.
Для инактивации вирусов чаще применяют ацетилэтиленимин (АЭИ) и особенно димер этиленимина (ДЭИ), который значительно менее токсичен по сравнению с этиленимином. Использование азиридинов для приготовления инактивированных противовирусных вакцин во многом обязано исследованиям с вирусом ящура.
Одним из стимулов к проведению этой работы были часто наблюдаемые «хвосты» инфекционного вируса в противоящурных вакцинах, инактивированных формалином. Так, в результате обработки 0,05%-ным формальдегидом в течение 144 ч при температуре 26°С и рН 8,9 не получали полной инактивации, тогда как 0,05%-ный ацетилэтиленимин оказался высокоэффективным при воздействии в течение всего 12 ч при 37°С [60].
Азиридины применяли и для инактивации других вирусов, в частности, бешенства (0,05% АЭИ, 65 ч, 37°С), псевдобешенства (0,05% АЭИ, 4% 37°С), пар-вовируса свиней (ЭИ-5 ММ, 48-72 ч, 26°С), везикулярной болезни свиней, классической чумы свиней и гриппа А.
Имеются сообщения о большой эффективности производных этиленимина по сравнению с другими инактивирующими агентами. Преимущество заключалось в получении безопасных препаратов с выраженными антигенными свойствами. Преимущества АЭИ по сравнению с бета-пропиолактоном доказаны на примере вирусов ящура, везикулярной болезни свиней и других вирусов. При инактивации вируса лейкоза крупного рогатого скота оптимальные результаты получены с АЭИ и ДЭИ. Оба агента вызывали инактивацию инфекционности вируса, не изменяя активности вирусного гликопротеина, тогда как при инактивации формалином наблюдалось существенное снижение антигенной активности. При инактивации вирусов с дцРНК этиленимин и его производные действовали менее эффективно. Инактивация некоторых вирусов в присутствии CuS04 происходила без потери иммуногенности.
