Белки и антигены вируса гепатита С. Диагностика ВГС
Сегодня известно минимум 10 структурных и неструктурных белков, кодируемых геномом HCV. К структурным белкам относят core, envelop 1 и envelop 2. Белок core является белком нуклеокапсида, тогда как envelop 1 и envelop 2 — гликопротеины внешней оболочки вируса. В структурной зоне кодируется также белок р7, функция которого не ясна, однако аналогия с другими представителями семейства Flaviviridae позволяет предположить, что его функция связана с высвобождением вириона из инфицированной клетки.
Этот белок отщепляется клеточной пептидазой от envelop 2, но не во всех случаях, что обусловливает существование envelop 2 в виде двух форм более и менее протяженной.
Неструктурная область генома HCV кодирует 6 белков — NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Белок NS2 является вирусной металлозависимой протеиназой. Белок NS4A действует как эффектор или кофактор для NSЗ-протеолитической активности в NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/NS5B сайтах нарезания полипротеина вируса.
В настоящее время фрагменты структурных и неструктурных белков, полученных генноинженерным путем (рекомбинантные белки) или с помощью химического синтеза, используют в качестве антигенов при конструировании иммуноферментных тест-систем. Первое поколение иммуноферментных тест-систем появилось на рынке в 1989 году и было основано на прямом ИФА. В качестве иммуносорбента были использованы фрагменты двух белков, NS3 и NS4, обозначаемых как 5-1-1 и С100-3.
Одновременно были разработаны и подтверждающие тесты на основе иммуноблота с рекомбинантными белками (RIBA). Чувствительность этих тест-систем первого поколения составляла только 64% для ИФА и 55% для иммуноблота. Тест-системы второго поколения появились на рынке в 1991 году. В качестве антигенов, сорбированных на твердой фазе, в этих тест-системах использовали капсидные белки (фрагмент с22-3) и антигены неструктурных регионов NS3 (фрагменты с200 и сЗЗс) и NS4, что позволило повысить чувствительность и специфичность исследований. Поскольку гуморальный иммунный ответ на капсидные антигены (структурные белки) нагинается быстрее, гем на неструктурные белки, период от инфицирования до выявляемой сероконверсии удалось уменьшить до двух месяцев.
Подтверждающие тест-системы на основе иммуноблота позволяли идентифицировать участвующие в реакции антигены. Результаты, полученные при помощи этих тест-систем, интерпретировали как положительные лишь при реакции антител, находящихся в исследуемом субстрате, по крайней мере, с двумя антигенами, тогда как при наличии реакции лишь с одним из антигенов результат считали неопределенным. Было установлено, что специфичность второго поколения тест-систем зависела от источника антигенов. В 1993 году на рынке появилось третье поколение тест-систем. В дополнение к вышеупомянутым антигенам в этих тест-системах используются также антигены, аминокислотная последовательность которых соответствует иммунодоминантным участкам NS5 белков.
В тест-системах первого, второго и третьего поколений в качестве антигенов использовались или рекомбинантные, или синтетические пептиды. В настоящее время можно выделить также тест-системы четвертого поколения, в которых в качестве иммуносорбента используют сочетания рекомбинантных и синтетических пептидов.
Опыт применения тест-систем различных поколений в мире очень большой. Было установлено, что если с помощью тест-систем первого или второго поколения у больных с острым вирусным гепатитом С антитела выявляли на 10-16, а в ряде случаев и 25-30 неделе от начала заболевания, то диагностикумы третьего поколения позволяли сократить этот срок до 2-3 недель. Согласно обобщенным данным чувствительность тест-систем первого, второго и третьего поколений составляет соответственно 70-80%, 92-95% и 97%.
В то же время, по данным С. Colin, 2001, чувствительность тест-систем третьего поколения составила 98,9% у пациентов с хроническими заболеваниями печени и 97,2% на специальных контрольных панелях сывороток. Достижение высокой чувствительности иммуноферментных тест-систем 3 и 4 поколения сопряжено с некоторыми проблемами в обеспечении специфичности исследований, что в ряде случаев может приводить к появлению ложноположительных результатов. В литературе имеются данные о возможных погрешностях в специфичности ELISA 3 тест-систем. Они являются общими для всех ELISA тест-систем, включая тест-системы для диагностики СПИДа.
Ложнопозитивные результаты могут быть следствием повышенного содержания в образцах гамма-глобулинов (сыворотки пациентов африканской расы, миеломная болезнь, ревматоидные факторы), заболеваний печени (цирроз, рак), аутоиммунных заболеваний (коллагенозы, аутоиммунные гепатиты), других вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит В) и длительного хранения сывороток в меняющихся температурных условиях. Проведение какой-либо иммунизации также может сопровождаться повышением частоты ложнопозитивных реакций. Рекомендуемые в настоящее время меры по устранению этой проблемы следующие: а) повторная постановка образца в этой же ИФТС; б) повторная детекция anti-HCV в другой ИФТС; в) использование подтверждающих тестов на основе ИФА и иммуноблота.
Однако использование предлагаемых способов подтверждения результатов зачастую приводят к расхождениям в их итоговой трактовке, что показано исследованиями российских и зарубежных исследователей.
В настоящее время производители ИФТС для детекции anti-HCV достигают высокой чувствительности или за счет более полного выявления антител к NS3 или антител к антигенам core. Сравнительные исследования, выполненные на различных группах риска и специальных контрольных панелях показали, что тест-системы, лучше выявлявшие антитела к NS3, оказались несколько более чувствительными, чем тест-системы, лучше выявлявшие антитела к антигенам core. Их чувствительность составляла, соответственно 99,9% и 98,6%.
