Полимеразная цепная реакция в стоматологии. Ценность ПЦР для стоматолога
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод, широко распространившийся в последнее время в клинической диагностике. Метод имитирует естественную репликацию нуклеиновых кислот и позволяет получать фрагменты последовательности ДНК в количествах, достаточных для детекции.
В настоящее время использование ПЦР стремительно расширяется в диагностике инфекционных, онкологических, генетических заболеваний и для идентификации личности. В отличие от И ФА ДНК-диагностика позволяет выявить возбудителя заболевания напрямую — его геном. С помощью специальных схем постановки ПЦР можно определять патогенные организмы в очень низкой концентрации.
ПЦР клинического образца включает в себя три основных этапа: пробоподготовка (выделение ДНК из клинического материала), амплификация (умножение фрагментов ДНК) и регистрация результатов. В каждом цикле число копий амплифицируемого участка удваивается. За 30—40 циклов происходит накопление коротких специфических фрагментов в количестве, достаточном для их дальнейшей детекции.
Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле, или путем гибридизации со специфическим олигонуклеотидным зондом, или с использованием метода масс-спектрометрии и т. д.
Метод ПЦР нашел широкое применение в изучении естественных микробных сообществ как позволяющий обнаружить микроорганизмы, не поддающиеся выявлению другими методами. Основной прием, использующийся исследователями, — применение универсальных праймеров, гибридизующихся с генами рРНК всех микроорганизмов.
Полученные амплифицированные фрагменты ДНК (в идеале столько, сколько видов имеется в данном микросообществе) затем секвенируют — устанавливают последовательность нуклеотидов в них и сравнивают с последовательностями известных микроорганизмов для установления филогенетических отношений.
Если при этом обнаруживаются новые виды, то данные секвенирования можно использовать для разработки новых праймеров для этих новых микроорганизмов. Кроме того, можно грубо оценивать количественное соотношение видов в сообществе, если добавить в среду реакции одновременно универсальный праймер и специфичный для данного вида.
После амплификации определяют их соотношение и рассчитывают приблизительное количество клеток. Метод весьма грубый из-за того, что в геноме разных клеток содержится от 1 до 10 копий генов рРНК и это затрудняет точный подсчет. Быстрый предварительный анализ сообщества осуществляли Li и соавт., проводившие электрофорез ампликонов в градиенте мочевины и формамида, что позволяло разделить фрагменты ДНК не только по длине, но и в зависимости от содержании G+C (в градиенте мочевины и формамида).
Схема с использованием универсальных праймеров достаточно хорошо работает, если видов в микробном сообществе немного (до 20). При большем количестве видов микроорганизмов, например в ситуации с клиническими образцами, возникают многочисленные технические трудности: недостаточное разрешение полос при электрофорезе, преимущественная амплификация одних генов в ущерб другим, недостаток субстратов для ДНК-полимеразы, неодинаковый лизис микроорганизмов в процессе пробоподготовки и др.
Одной из причин артефактов при изучении микросообществ с помощью ПЦР является формирование химерных последовательностей — соединение последовательностей ДНК из разных видов. Химера образуется, когда недозрелый терминированный ампликон комплементарно присоединяется к нематеринской ДНК-матрице и копируется в последующих циклах ПЦР.
Усиливают образование химерных рДНК следующие факторы: 1) присутствие в среде реакции обрывков ДНК (при выделении) или их накопление вследствие недостаточной продолжительности стадии полимеризации; 2) повышенное количество высококонсервативных повторов; 3) высокая степень родства между исследуемыми организмами. Формирование химерных ДНК дает в результате ложное увеличение биоразнообразия сообщества.
