Биохимические методы идентификации в стоматологии. Биохимия зубных бактерий
В течение всей первой половины XX в. дифференциация микроорганизмов проводилась по их способности утилизировать различные субстраты. В 1911 г. Russell описал среду с двумя сахарами, которая позволяла разделить организмы тифоидные, паратифоидные и дизентерийные. Simmons показал, что с помощью цитрата в качестве единственного источника углерода можно отл ичать роды и виды бактерий, особенно если добавить к среде агар и бромтимоловый синий. В 1946 г. Christinsen ввел в обиход среду, на которой можно было выявить активность уреазы. Одновременно с развитием таких биохимических тестов исследователи приложили немало усилий для сокращения времени, требуемого на реализацию этих тестов.
В 1948 г. Arnold и Weaver описали микротехнику для выявления синтеза индола бактериями за время от 6 мин до 2 ч при условии использования густого инокулюма микроорганизмов в 1 мл среды. В 1949 г. Soto проверил способности микроорганизмов утилизировать углеводы с использованием бумажных дисков, пропитанных углеводами и бромкрезоловым пурпурным. Это сильно уменьшило количество нужной для анализа среды, которая готовилась вручную, и позволило наблюдать результаты всего через 8 ч. В 1962 г. Le Minor и Hamida показали, что результаты по выявлению активности р-галактозидазы можно получить уже через 1 ч. В 1963 г. Vracko и Sherris адаптировали концепцию использования бумажных дисков и полосок для разработки spot-тестов.
В 1964 г. General Diagnostics Division of Warner-Chilcott Laboratories вывела на рынок бумажные полоски с реагентами PathoTec, которые позволяли выявлять некоторые специфические ферменты, синтезируемые клинически значимыми бактериями: лизин- и орнитиндекарбоксилаза, уреаза, фенилаланиндеаминаза, ферменты гидролиза эскулина и синтеза индола. Этим было положено начало коммерческим системам идентификации, ручным и автоматизированным, с помощью которых можно было корректно идентифицировать микроорганизмы.
Все коммерческие биохимические системы идентификации основаны на выявлении пяти основных свойств:
• изменение рН-среды при росте бактерий (требуется 15—24 ч);
• определение активности ферментов (2—4 ч);
• утилизация различных типов углеводов;
• образование видимых колоний микроорганизмов;
• детекция летучих или нелетучих жирных кислот с помощью газовой хроматографии.
Изменение рН-среды происходит из-за жизнедеятельности бактерий (при утилизации преимущественно углеводов накапливаются кислоты, белков — соединения с щелочной реакцией) и выявляется по изменению цвета красителя. Скорость изменения рН зависит от количества внесенных в ячейку клеток бактерий, времени и температуры инкубации. Поскольку время роста клеток в ячейке довольно велико — более 15 ч — все операции требуется проводить асептически во избежание размножения посторонней микрофлоры.
В 1980 г. Bascomb и Spencer описали некоторые автоматизированные методы для измерения активности ферментов в бактериальной суспензии, которые могли дать результаты в течение 6 ч. Изменения цвета в этих системах было следствием гидролиза или обесцвечивания комплекса соответствующего фермента с хромогеном или флюорогеном. Из-за укорочения времени инкубации, нужного для выявления деятельности фермента, проблема контаминации не была актуальной.
Для того чтобы выяснить, какой набор углеводов может использовать микроорганизм для своего роста, в ячейки со средой, отличающейся только видом сахара, вносят суспензию испытуемого микроорганизма и наблюдают за изменением окраски красителя тетразолия фиолетового. Изменение происходит за счет переноса электронов от продукта реакции переработки углевода на краситель: если углевод не усваивается, то окраска меняться не будет.
Четвертый метод — простая визуальная детекция роста проверяемого микроорганизма в присутствии субстрата: размножающиеся клетки вызывают помутнение среды в ячейке. Эта реакция также длительная и требует не менее 10 ч.
Пятый метод идентификации — хроматография конечных продуктов метаболизма жирных кислот — используется не очень широко, но отличается большей информативностью и меньшим временем анализа по сравнению с остальными методами. Основан он на том, что крупные группы микроорганизмов отличаются друг от друга характерным набором фосфолипидов клеточной мембраны. Недостатком данного метода является то, что нельзя идентифицировать роды и виды микроорганизмов.
