Микроскопия и культивирование в стоматологии. Определение чувствительности к антибиотикам
Изучение качественного состава микроорганизмов в зубном налете, содержимом зубодесневых борозд и ПК проводят с помощью микроскопии в темном поле или фазово-контрастной микроскопии по М. О. Биргеру (1982).
При фазово-контрастной микроскопии определяют процентное содержание пяти морфологических форм микроорганизмов (кокки, неподвижные палочки, подвижные палочки, извитые формы, филаменты). Рассчитывают коэффициент устойчивости микроорганизмов как соотношение неподвижных и подвижных форм микроорганизмов.
Со времен Коха и Пастера культивирование было основным методом выделения и изучения свойств микроорганизмов. Современные знания о свойствах микрофлоры ротовой полости были получены с использованием культуральных методов, и молекулярно-биологические работы по изучению орального микробного сообщества в основном подтверждают данные классических исследований, лишь несколько расширяя спектр микроорганизмов биопленки.
Помимо классических и синтетических сред было разработано множество селективных сред, поддерживающие рост только определенных групп микроорганизмов, и дифференциальных, на которых колонии нужного вида клеток окрашивались, тогда как остальные оставались бесцветными. Однако во всех случаях формирование колонии проводится из единственной клетки — чистой культуры, которая в дальнейшем характеризуется микроскопически и/или по физиологическим и биохимическим свойствам.
Одним из часто применяющихся в клинической практике культуральных микробиологических методов является метод посева по Gold (метод секторных посевов).
Для определения количественного состава микроорганизмов методом посева по Gold материал собирают с помощью стерильного стандартного диска диаметром 6 мм, изготовленного из целлофановой пленки толщиной 40 мкм.
Диск вводят в ПК пуговчатым зондом так, чтобы он был согнут пополам. Оставляют на 1 мин для заполнения пространства между согнутыми краями диска содержимым ПК, после чего диск извлекают пинцетом и помещают в пробирку с фосфатным буфером. Взвесь тщательно гомогенизируют и делают посев на кровяном агаре, используя бактериологическую петлю диаметром 2 мм (емкость 0,005 мл). По окончании инкубации проводят подсчет колоний по секторам.
Количественный состав микроорганизмов оценивают по числу микроколоний на 1 ед. площади диска.
Метод полуколичественной оценки роста аэробной и анаэробной флоры разработан для культивирования факультативных анаэробных микроорганизмов. Материал для микробиологического исследования забирают целлофановым диском и помещают его в пробирки с питательной средой для контроля стерильности, обогащенную пептоном, с добавками твина и гемина (производства г. Оболенск, Московской обл.). Создание анаэробных условий при использовании этой среды обеспечивается содержанием в ее составе тиогликолята натрия.
Образование колоний после инкубации на поверхности питательной среды и в глубину до 1 см оценивают как рост аэробной флоры, а формирование колоний в более глубоких слоях питательной среды — как рост факультативных анаэробных микроорганизмов.
Для выявления дисбиотических сдвигов в полости рта проводят исследование микрофлоры на дисбактериоз по критериям В. В. Хазановой (1996): дисбиотический сдвиг, дисбактериоз I—II, III и IV степени.
Для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используют два метода: диско-диффузионный и метод разведений антибиотика в плотной или жидкой питательной среде.
Методика С. М. Навашина (1982) заключается в определении чувствительности выделенной микрофлоры к антибиотикам путем диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных антибиотиками.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют по диаметру окружности свободной от колоний зоны вокруг диска, которая свидетельствует о задержке роста микрофлоры: чувствительный, среднеустойчивый, устойчивый.
Необходимо отметить, что примерно 50—60 % микрофлоры, вегетирующей в тканях пародонта, относятся к трудно культивируемым видам микроорганизмов. Некоторые микробы не формируют видимых глазом колоний. Другие микроорганизмы иногда переходят в некультивируемое состояние при обработке солевыми растворами, ледяной водой, низкими температурами. Третьи просто не способны усваивать питательные вещества из сред, стандартно применяемых для культивирования, так как требуют каких-то симбионтов, или питательных добавок, или нуждаются в особых поверхностях для прикрепления и нормальной жизнедеятельности.
Следовательно, определенные виды микроорганизмов не могут быть получены в виде чистой культуры и могут быть охарактеризованы только косвенно.
