Определение липопротеидов крови. Определение глюкопротеидов крови
Для определения липопротеидов используется тот же буфер, что и для электрофореза. Ленты готовят так же, как и для белковых фракций.
В качестве красителя применяется судан черный: 25 мг судана черного на 10 мл абсолютного спирта. Срок годности такого раствора 1 месяц, хранят его в холодильнике.
Электрофорез липопротеидов производят заранее окрашенной сывороткой. Для этого к 0,5 мл свежей, негемолизированной сыворотки добавляют 0,1 мл Судана черного. Смесь перед нанесением на бумагу 1 час взбалтывают, затем наносят на 0,1 мл смеси. Ленты помещают в камеру на 3 часа при напряжении 300 в, пока происходит разделение фракций. Ленты вынимают и сушат в горизонтальном положении при температуре 80°. Затем разрезают фракции для количественного определения. Разрезанную по фракции ленту помещают в пробирку и заливают 20% уксусным спиртом по 5 мл в каждую (20 мл уксусной кислоты и 80 мл спирта). Закрывают пробирки пробками и ставят в темное место на 2 часа. Раствор колориметрируют в ФЭК с синим светофильтром в 5-миллиметровой кювете. Полученные цифры суммируют и принимают за 100%. Вычисляют процентное содержание каждой фракции. В норме получают 30% (26—35%) альфа-липопротеидов и 70% (74—65%) бета-липопротеидов.
Определение глюкопротеидов крови
Электрофорез производят так же, как при разделении белков. Для определения глюкопротеидов необходимы следующие реактивы.
Реактивы: I. 1% раствор HJO4 (йодная кислота) хранить в холодильнике одну неделю.
II. Восстанавливающий раствор готовят по методу Грина: 50 кг KJ (йодистый калий) и 50 г гипосульфита растворяют в 1 л Н20 (раствор А), 35 мл IN раствора доводят до 1 л дистиллированной Н20 (раствор В). Перед употреблением сливают две части раствора А и 3 части раствора В.
III. Реактив Шиффа. 4г основного фуксина (специальный сорт для реактива Шиффа) растворяют в 1 л дистиллированной воды, нагретой до 90—95°. Раствор тщательно перемешивают до тех пор, пока его температура не достигнет 40°. После этого к раствору фуксина прибавляют 8 г метабисульфита К и 10 мл концентрированной соляной кислоты. Раствор оставляют в плотно закрытой склянке на 16—18 часов, затем к нему прибавляют 2 г активированного угля, тщательно перемешивают и отфильтровывают на воронке Бюхнера. Раствор должен быть абсолютно прозрачным и бесцветным. Хранить его следует в холодильнике и использовать не более одного месяца.
IV. Раствор для промывания электрофореграмм. 16 г метабисульфита К растворяют в 2 л Н20. К 500 мл этого основного раствора прибавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты (раствора А). К остающемуся 1,5 л основного раствора прибавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (раствор В). Раствор готовят непосредственно перед употреблением. Наилучшие результаты были получены при окислении в течение 10 минут 1% раствором йодной кислоты. В этих условиях получается яркая окраска фракций глюкопротеидов и бесцветный фон.