Белковые фракции сыворотки крови. Техника выделения фракций белков крови
В настоящее время наиболее распространено определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге (Р. С. Колесникова, 1959; П. А. Веселова, 1961; В. К. Гостищев, 1965; К. А. Цыбырнэ, 1965, и др.).
Этим способом разделяются 5 фракций белка: альбумины, альфа-1, альфа-2, бета- и гамма-глобулины. Для обнаружения белковых фракций используют свойство белков связывать некоторые красители. Содержание белковой фракции определяют по количеству связанного с ней красителя.
1. Раствор для отмывания электрофоре грамм от несвязавшейся с белком краски: 2% раствор уксусной к-ислоты для бромфенолового синего.
2. Для элюирования бромфенолового синего применяют 0,01 едкий натр.
3. Бумага. Хроматографическая быстро впитывающая бумага марки «Б» или медленно впитывающая марки «М» Ленинградской бумажной фабрики им. Володарского. Следует все время работать с одним выбранным сортом бумаги. Для электрофореза на бумаге необходимы камера и источник постоянного тока, а для количественной расшифровки — ФЭК-Ж.
Камера ПЭФ состоит из ванны, в которой помещены две кюветы, разделенные перегородкой. В наружной части кюветы погружено по два угольных электрода. Электрическая связь между внутренними кюветами осуществляется при помощи полос хроматографической бумаги, подвешенных на перегородке кювет. Кюветы заливают доверху буферным раствором. Регулировочными винтами устанавливают камеру в горизонтальное положение по уровню. Хроматографическую бумагу нарезают полосами шириной 3 см и длиной 26 см. Бумагу следует аккуратно нарезать лезвием, без складок и изъянов, лучше вдоль листа.
Отмечают черным карандашом середину полосы и место нанесения сыворотки — 3 см от катода. После этого ленты помещают в камеру, причем концы их должны быть опущены во внутреннее отделение кювет. Камеру закрывают двускатной крышкой, подключают к источнику питания на 1/2 часа. После этого выключают ток, снимают крышку и при помощи пипетки наносят на отмеченное на полосе место ровным слоем сыворотку в количестве 0,015 мл, затем закрывают камеру и включают ток. Электрофорез проводят при комнатной температуре, при напряжении 175—200 в в продолжение 5 часов. По окончании электрофореза ток выключают.
Сушат электрофорез в сушильном шкафу в горизонтальном положении в течение 15 минут при 105°, после этого ленты окрашивают в эмалированных кюветах, погружая их на 20—30 минут в раствор бромфенола синего. Затем раствор сливают, а не связавшийся с белками краситель удаляют, промывая отдельными порциями 2% уксусной кислоты до тех пор, пока последняя порция уксусной кислоты не останется бесцветной. Ленты сушат при комнатной температуре. Для элюирования участки ленты, содержащие каждую фракцию, вырезают и помещают в пробирку, а альбумины — в стаканчик. Встряхивают и оставляют на 1/2 часа, а затем колориметрируют в ФЭК с зеленым светофильтром в 5-миллиметровой кювете. Если нужно получить более интенсивную окраску фракции, то высушенные ленты проводят над открытой бутылкой с аммиаком.
После колориметрирования складывают экстинкции всей фракции (экстинкцию альбуминов утраивают). Для получения хороших электрофореграмм необходимо соблюдать все правила, указанные в методике, и внимательно следить за буфером, рН которого должно быть постоянно. Угольные электроды очень загрязняют буфер, поэтому его необходимо часто менять.
