Микроскопия для выявления Y-хроматина. Исследование препаратов на Y-хроматин
Препараты изучают под люминесцентным микроскопом. Поиск клеток и ядер производят, соблюдая определенный порядок, с объективом 20X, а анализ их структуры с объективом 90X, предварительно нанеся на покровное стекло каплю иммерсионного нелюминесцирующего масла.
В правильно окрашенном препарате фон темный или слегка зеленоватый; цитоплазма клеток бледная, прозрачная, слабо флюоресцирующая , ядра — ярко флюоресцирующие желтовато-зеленые. Под иммерсионным объективом хорошо различима неравномерная флюоресценция участков ядра: одни из них светятся сильнее, другие выглядят темными.
Тельца Y-хроматина выделяются самой яркой флюоресценцией и четкими контурами. Глыбки Ф-хроматина, если они видны, представляют собой светящиеся точки.
В препаратах, приготовленных из объектов экспертизы, всегда имеется большее или меньшее количество измененных непригодных для диагностики ядер. Такими изменениями можно считать отсутствие оболочки ядра, части хроматина, значительное ослабление окраски и гомогенность хроматина; у нейтрофилоцитов — округление ядер, утрату ими части сегментов.
В препаратах, приготовленных из следов крови на невпитывающих жидкость предметах-носителях (стекло, металл и др.), основным препятствием для выявления Y-хроматина является фибрин, который обволакивает ядра светящейся сетью. Эпителиальные клетки, извлеченные из следов слюны, располагаются в препаратах изолированно и группами, лежащими в один, иногда в 2—3 слоя.
Нужно иметь в виду, что при наложении одной клетки на другую ослабляется контрастность свечения Y-хроматина из-за интенсивно светящегося фона, образованного свечением нескольких ядер. Поэтому если в препарате много клеток, то целесообразно изучать только изолированные.
Препараты, приготовленные из волос, имеют свои особенности, которые могут затруднять и ограничивать обнаружение Y-хроматина. Главная из них — наличие жира (при недостаточно хорошей обезжиренности волоса), который покрывает клетки светящейся пленкой и маскирует Y-хроматин. Кроме того, при недостаточно тщательном измельчении корневого влагалища выявление Y-хроматина невозможно из-за яркого общего свечения крупных фрагментов эпителиальной ткани.
Выявление Y-хроматина осложняется наличием микроорганизмов, волокон и других включений, из-за яркого свечения которых ослабляется зрительное восприятие флюоресценции хроматина, особенно в ядрах, лежащих рядом с такими включениями. Помехой для выявления Y-хроматина могут служить микроорганизмы полости рта, которые в препарате светятся интенсивно и, попадая на ядро, и иногда имитируют Y-хроматин.
Поэтому каждое ядро необходимо рассматривать внимательно, перемещая его к центру поля зрения и производя непрерывную фокусировку, чтобы выявить четко Y-хроматин и отличить от него посторонние включения.
Следует иметь в виду случаи, когда наряду с четкой выявляемостью Y-хроматина в лимфоцитах его не удается обнаружить в ядрах нейтрофилоцитов, что не связано с давностью следов крови. По-видимому, этот факт можно объяснить тем, что нейтрофилоциты отличаются от лимфоцитов меньшей механической и осмотической резистентностью, а также высокой активностью гидролитических ферментов.
Поэтому они более подвержены неблагоприятным влияниям среды в период подсыхания крови. По этой причине при диагностике пола учитывают данные, полученные только при исследовании лимфоцитов.
