Количественные методики в онкоморфологии. Проточный подсчет количества ДНК в клеточной популяции
Количественные методики в онкоморфологии необходимы и применяются там, где требуется цифровое выражение морфологических особенностей опухоли для объективизации признаков и статистической обработки. Эти методики, особенно при автоматизированном (машинном) учете, способствуют более точной диагностике при минимальных изменениях, выделению ведущих признаков из комплекса таковых при наличии нескольких опухолевых поражений, стандартизации параметров для сравнительного исследования.
Существует целый набор количественных методик, применяющихся при изучении новообразований и включающих стереологические измерения (определение относительных объемов, площадей поверхности, отношений первого ко второму параметру, относительных размеров, относительной плотности объектов), автоматический анализ изображения, микроспектрофотометрию и проточную цитометрию. Здесь нет возможности уделить внимание всем указанным методикам. Приходится остановиться лишь на тех, которые применяются в онкоморфологии чаще всего. Рассмотрим измерение содержания ДНК с помощью проточной цитометрии и содержания ядрышковых организаторов при светооптической микроскопии. Повышение этого содержания является по существу важнейшим неспецифическим маркером опухолевой трансформации и малигнизации ткани.
Первая методика — проточного подсчета количества ДНК в клеточной популяции — была предложена в середине 60-х годов. Она использовалась при скрининге цитологических мазков из шейки матки на предмет раннего выявления рака. В дальнейшем методика была значительно усовершенствована. Суспензии клеток, подвергавшихся анализу, централизовали в анализирующем пучке света, собрав их в поток, проходящий внутри слоев протекающей жидкости. Был также найден источник мощного излучения в виде аргонового лазера. Совершенствовались и сортирующие установки.
Методика принципиально заключается в следующем. Ткани подвергаются дисагрегации с помощью ферментов. Свечение, испускаемое люминесцирующими клетками, меченными флуорохромами по прямой или непрямой методике, попадает на фотоиндикаторы, с которых сигнал подается на компьютер. Перемещающийся сигнал с компьютера заряжает жидкостный поток, вызывая его отклонения на соответствующую величину согласно определенным параметрам клеток в ходе их прохождения между заряженными электродами. Отсортированные клетки собираются в разные емкости.
Размеры клеток могут быть определены после переднего углового светового рассеивания; оно прямо пропорционально этим размерам, конечно, только если клетки в суспензии сферичны или околосферичны. Показатели гранулярности цитоплазмы выводятся из интенсивности светового рассеивания под углом 90°. Эти показатели могут быть измерены одновременно с флуоресценцией поверхностных маркеров или ядерных меток (например, ДНК, окрашенной флуорохромами); затем можно использовать сразу много параметров для построения трехмерных гистограмм.
Для определения плоидности опухолевых клеток по содержанию ДНК клеточная суспензия окрашивается каким-либо флуорохромом. Из красителей чаще употребляют пропидиум иодид и этидиум бромид, которые, правда, связываются также с РНК. Чтобы этого избежать, на клетки воздействуют РНКазой. Из других флуорохромов используют нередко окридин-оранж. Он дает сильное зеленое свечение при связывании с двуспиральной нитью и оранжево-красное — при связывании с односпиральной нитью нуклеиновой кислоты. Таким образом, возможен одновременный анализ содержания ДНК и РНК в одном препарате.
Однократное исследование распределения ДНК в клеточной популяции с помощью проточной цитометрии обеспечивает быстрое получение данных о клеточном цикле. Клетки, находящиеся в фазе цикла G0/G1 диплоидны (2с), в фазе G2 и М — тетраплоидны (4с), а в фазе S — занимают промежуточное положение между пиками 2с и 4с. Конечно, тетра- или анэуплоидные клетки определимы только относительно диплоидных, дающих контрольные величины плотности размещения ДНК. В опухолевой ткани обычно отыскивают инфильтрующис ее лимфоциты и по ядрам последних определяют контроль диплоидного содержания ДНК.
Важным приспособлением в методике проточной цитометрии является сортинг, т. е. разъединение и сортировка клеток. Тонкий поток жидкости, несущий клеточную суспензию, с помощью мелкой вибрации разбивается на маленькие капельки такого размера, чтобы в каждой умещалась только одна клетка. Капельки падают, пролетая между металлическими пластинками, несущими противоположные электрические заряды. Если определяемые параметры каждой клетки в ходе ее прохождения через считывающий поток удовлетворяют первоначальным показателям, аппарат, заранее запрограммированный на тот признак, по которому идет сортинг, выдает в поток отрицательный или положительный электрический заряд, заставляющий этот поток отклоняться после прохождения электродов под воздействием электростатических сил в ту или иную сторону на ту или иную величину. Капельки с клетками собираются, будучи уже рассортированными, и подвергаются дальнейшему анализу.
Например, если нужно выделить Т-лимфоциты из смешанно-клеточной популяции, суспензию следует вначале подвергнуть воздействию Т-лимфоцитарных антител в прямой или непрямой иммунофлуоресцентной постановке. После этого все Т-клетки станут флуоресцирующими. Поскольку каждая их них пройдет через лазерный поток, то индуцированное свечение будет анализироваться, и если оно превысит или не будет достигать заданного предела, то сигнал определенной силы пойдет на металлические пластинки. Соответствующие силы электрического поля рассортируют клетки в собирательные сосуды, в которых затем они будут сосчитаны. В современных установках скорость анализа определяется величиной 10 000 клеток в секунду, а скорость сортировки — 5 000 клеток в секунду.
Принципиальным ограничением для методики проточной цитометрии является необходимость получения такой суспензии, в которой каждая клетка размещалась бы обособленно. Поэтому при изучении опухолевой ткани наилучшим объектом является ткань солидного строения. Эта ткань подвергается ферментной дисперсии, которая, к сожалению, подчас повреждает довольно много клеток, и дальнейший отбор может не учесть множество наиболее репрезентативных элементов. Правда, в конце 80-х годов появились новейшие приспособления, позволяющие указанные недостатки если не избежать, то свести к минимуму.
