Генетика
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Генетика:
Генетика
Аномалии хромосом
Биология клетки
Генетика врожденных пороков
Генетика рака - опухолей
Молекулярная генетика
Цитогенетика - исследование хромосом
Лечение наследственных болезней
Фармакогенетика
Рекомендуем:
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Саузерн-блоттинг в молекулярной генетике. Особенности

Исследование РНК или ДНК конкретного гена предполагает возможность различить специфические сегменты ДНК или молекулы РНК, соответствующие этому гену, среди множества других сегментов ДНК или молекул РНК, присутствующих в образце клеток или ткани. Когда анализируют геномную ДНК, проблема состоит в том, чтобы обнаружить и изучить специфический интересующий фрагмент ДНК в сложной смеси, содержащей несколько миллионов фрагментов, полученных расщеплением геномной ДНК рестриктазами. С образцами РНК сложность в том, чтобы обнаружить и измерить объем и качество конкретной копии мРНК в суммарной РНК ткани, в которой искомая мРНК составляет менее 1 на 1000 от общего числа копий РНК.

Решение проблемы обнаружения одной редкой последовательности среди множества других связано с использование гель-электрофореза для разделения молекул ДНК или РНК по размеру с последующей гибридизацией с нуклеотидным зондом, идентифицирующим интересующую молекулу.

Техника Саузерн-блоттинга (блоттинга по Саузерну) позволяет обнаружить и изучать на грубом уровне множество интересующих фрагментов в, казалось бы, не информативной коллекции из порядка миллиона фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазами. Саузерн-блоттинг, разработанный в середине 1970-х годов, стал стандартным методом исследования конкретных фрагментов ДНК, расщепленной ферментами рестрикции. Сначала в ходе этой процедуры из доступного источника выделяют ДНК. Как источник ДНК может быть использована любая клетка организма, за исключением зрелых эритроцитов, не имеющих ядра.

В ходе анализа образцов ДНК пациента обычно используют геномную ДНК лимфоцитов, полученных при обычной пункции вены. В 10 мл периферической крови содержится приблизительно 108 лейкоцитов или около 100 микрограмм ДНК — доза, достаточная для расщепления рестриктазами. Геномная ДНК также может быть получена из других тканей, включая культуру фибробластов кожи, амниотических клеток или ворсин хориона, что используют для пренатальной диагностики, или из биопсийного образца ткани различных органов (например, печени, почки, плаценты).

саузерн-блоттинг в генетике

Пробу с миллионами различных фрагментов ДНК, генерируемых ферментативным расщеплением образца геномной ДНК рестриктазами, наносят на поверхность агарозного геля в точку старта. Затем фрагменты ДНК разделяют по размеру с помощью электрофореза в геле агарозы, при котором мелкие частицы перемещаются в электрическом поле быстрее крупных. Когда разделенную таким образом исследуемую ДНК окрашивают флюоресцентным красителем, например этидиум бромидом, фрагменты ДНК проявляются как флюоресцирующие области, распределенные вдоль полосы движения в геле, меньшие фрагменты — выше, большие — ниже. ДНК появляется в геле как смазанное пятно, а не в виде дискретных полос, поскольку обычно образуется слишком много разноразмерных фрагментов ДНК, чтобы отделить один от другого.

Пятно двухнитевых фрагментов ДНК сначала денатурируют сильной щелочью для разделения нитей ДНК. Полученные однонитевые молекулы ДНК затем переносят с геля на бумажные пористые фильтры (отсюда второе название метода — «перенос по Саузерну»).

Для идентификации одного или нескольких интересующих фрагментов среди миллионов других фильтр инкубируют с комплементарным однонитевым меченым зондом в условиях, способствующих спариванию двойных молекул ДНК. Несвязанные зонды удаляют отмывкой, затем фильтр со связанными радиоактивными зондами выдерживают с фотопленкой, что выявляет положение одного или более фрагментов, к которым присоединился зонд. Таким образом, на пленке можно увидеть специфические радиоактивные полосы для каждого интересующего фрагмента ДНК человека на исходном геле.

Способность Саузерн-блоттинга идентифицировать мутации ограниченная, поскольку зонды могут обнаруживать дефекты, только имеющие ощутимое влияние на размер рестрикционного фрагмента, например крупные делеции или инсерции (вставки). Мутация, изменяющая одно или несколько оснований, не может быть обнаружена, если не создает или не уничтожает сайт узнавания рестриктазы, приводя к значительному изменению размера фрагмента, обнаруживаемого зондом. Тем не менее, кроме Саузерн-блоттинга, существует множество методов для обнаружения мутаций, влияющих на одну или несколько пар оснований в гене.

- Читать далее "Аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды в молекулярной генетике. Особенности"


Оглавление темы "Молекулярная генетика":
  1. Ферменты рестрикции. Применение в молекулярной генетике
  2. Векторы, плазмиды в молекулярной генетике. Что такое вектор, плазмида?
  3. Библиотеки в молекулярной генетике. Что такое библиотека?
  4. Скрининг библиотек гибридизационными зондами в молекулярной генетике. Особенности
  5. Саузерн-блоттинг в молекулярной генетике. Особенности
  6. Аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды в молекулярной генетике. Особенности
  7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности
  8. Молекулярный анализ мутаций у человека. Рекомендации
  9. Анализ последовательности ДНК. Особенности
  10. Методы анализа изображений флюоресцентно меченных нуклеотидов. Особенности
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта