• Динамическая нестабильность является основным способом перестройки (обмена) микротрубочек в клетке
• Плюс-концы микротрубочек намного более динамичны в клетках, чем в системе in vitro
• Свободные минус-концы никогда не растут; они или стабилизируются, или деполимеризуются
• Клетки содержат субпопуляцию нединамичных стабильных микротрубочек
В клетках микротрубочки подвергаются сборке и разборке, которая обеспечивается механизмом динамической нестабильности. Поскольку понятие динамической нестабильности подразумевает одновременный рост одних микротрубочек и укорачивание других, в каждом конкретном случае для выяснения механизма необходимо наблюдать за индивидуальными микротрубочками в клетке.
Для того чтобы иметь возможность проследить за сборкой микротрубочек, необходимо пометить тубулин с помощью флуоресцентной метки. Это достигается с помощью экспрессии тубулина, связанного с флуоресцирующим белком, или при введении в клетки очищенного тубулина, конъюгированного с флуоресцентным красителем. После этого клетки исследуют под световым микроскопом и через каждые несколько секунд регистрируют интенсивность флуоресценции. С помощью этого метода было получено статическое изображение микротрубочек в живой клетке, представленное на рисунке ниже.
В точках, примыкающих к краям клетки, можно видеть много отдельных микротрубочек, которые попеременно растут и укорачиваются. Такие типы микротрубочек часто расположены рядом друг с другом.
На рисунке ниже показаны две такие микротрубочки, расположенные рядом, ближе к краю клетки — одна из них растет, другая диссоциирует.
Описанный метод можно использовать для измерения длины микротрубочек с течением времени и для сравнения их поведения в клетках и in vitro. Было показано, что динамическая нестабильность микротрубочек, которые собираются in vitro из очищенного тубулина, и тех, которые находятся в клетках, различна. В живых клетках плюс-концы микротрубочек гораздо более динамичны, чем у микротрубочек, полимеризованных из очищенного тубулина.
Кадр видеосъемки клетки, которая экспрессирует флуоресцирующий тубулин.
Микротрубочки окрашены зеленым цветом. Видеосъемка показывает, что за счет динамической нестабильности многие микротрубочки растут и укорачиваются.
В двух выделенных областях клетки находятся динамические микротрубочки.
На рисунке ниже представлена серия изображений, полученных для одной из этих областей.
Плюс-концы микротрубочек в клетках растут в 5-10 раз быстрее, чем in vitro. Как следует из рисунка ниже, микротрубочки, находящиеся в клетках, также чаще переключаются от процесса роста к укорочению. Для микротрубочек in vitro реже наблюдаются паузы, в продолжение которых не регистрируется ни роста, ни укорочения. Для микротрубочек в клетке такие паузы регистрируются часто. Эти различия между характером динамики микротрубочек in vitro и in vivo свидетельствуют о том, что клетка меняет динамическую нестабильность, ускоряя или замедляя этот процесс.
Как будет ясно из дальнейшего изложения, это достигается за счет действия белков, связывающихся с микротрубочками.
Способность клеток регулировать процесс сборки микротрубочек впервые была продемонстрирована при сравнении их динамики в интерфазе и в митозе. Первоначально, для наблюдения за процессами, происходящими с микротрубочками в клетке, использовался метод, позволяющий измерить скорость, с которой в определенном участке клетки образуются новые микротрубочки. Эта техника называется методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). На рисунке ниже представлены фотографии, отражающие изменения микротрубочек, наблюдаемые с помощью FRAP.
Было показано, что интерфазные микротрубочки деполимеризуются и замещаются новополимеризованными микротрубочками с полупериодом 5-10 мин, в то время как митотические микротрубочки замещаются с полупериодом 0,5-1 мин. Прямое наблюдение за отдельными микротрубочками в митотических клетках с помощью вышеописанной техники показало, что увеличение скорости обмена связано с изменением частоты переходов (например, больше катастроф, меньше спасений) и сильным укорачиванием пауз. Пример изменения частоты переходов представлен на графике.
Изменение динамики микротрубочек, которое наблюдается при вступлении клетки в митоз, происходит с участием цитоплазмы. Динамика микротрубочек может регулироваться и в отдельных частях клетки. Например, для микротрубочек, расположенных вблизи клеточного центра, характерна небольшая вероятность наступления катастроф. Они постоянно растут по направлению к периферии клетки. Переключение между ростом и укорочением гораздо чаще происходит в областях, примыкающих к границе клетки вблизи от плазматической мембраны.
Если бы в глубине и на периферии клетки не было дифференциальной регуляции динамики, то лишь некоторые микротрубочки достигли бы ее границ.
Не для всех микротрубочек характерна одна и та же динамика. Многие интерфазные клетки характеризуются присутствием двух различных популяций микротрубчек, которые различаются по скорости обмениваемости. Одна из популяций обладает динамическим характером и обменивается быстро (в течение минут). Вторая состоит из микротрубочек, которые гораздо более стабильны и часто существуют в продолжение часа или дольше. Эти стабильные микротрубочки не растут и не укорачиваются на плюс-концах, что позволяет предполагать, что эти концы у них каким-то образом копированы. На рисунке ниже отчетливо видны различия между этими субпопуляциями.
Стабильные микротрубочки образуются из динамических, хотя пока неясно, каким образом это происходит. В клетках содержится несколько ферментов, которые различными путями ковалентно модифицируют а-тубулин. Возможно, что это играет определенную роль. Стабильные микротрубочки содержат гораздо больше модифицированного тубулина, чем динамические. Это позволяет предполагать, что они являются основными субстратами для этих ферментов и что модифицированные формы тубулина могут подавлять динамику микротрубочек Функции стабильных микротрубочек пока остаются неясными, однако очевидно, что в разных клетках содержится их различное количество.
В недифференцированных клетках примерно 70% микротрубочек представляют собой динамичные структуры, а 30% — стабильные. Стабильные микротрубочки гораздо более характерны для неделящихся дифференцированных клеток, таких как мышечные и эпителиальные, а также нейроны.
Нуклеация микротрубочек происходит на центросомах, однако не все микротрубочки остаются связанными с ними. Микротрубочки способны высвобождаться от центросом, однако скорость, с которой это происходит, зависит от типа клеток и стадии отхождения цикла. Отделение микротрубочек от центросом приводит к их появлению в цитоплазме со свободными плюс- и минус-концами. Свободные микротрубочки также могут образовываться при распаде связанных с центросомами форм.
Свободные микротрубочки могут существовать в клетке в том случае, если их минус-концы стабилизированы, хотя механизм стабилизации неизвестен. В фибробластах свободные микротрубочки быстро диссоциируют, и остаются только те из них, которые связаны с центросомами. В эпителиальных клетках и нейронах минус-концы структур стабильны, и свободные микротрубочки могут существовать в цитоплазме. Эти свободные микротрубочки могут транспортироваться и организовываться при помощи молекулярных моторов ставления о моторных белках микротрубочек), которые позволяют клеткам организовывать микротрубочки в структуры, отличные от радиальных, характерных, например, для фибробластов.
В некоторых клетках, в которых микротрубочки не связаны с центросомами, они подвергаются перестройке (тредмиллингу). Этот процесс характеризуется тем, что за счет динамической нестабильности общий рост микротрубочки обеспечивается преимущественным наращиванием плюс-конца, в то время как минус-конец укорачивается. За счет этого процесса тубулиновые субъединицы присоединяются к плюс-концу и отщепляются с минус-конца. При этом длина микротрубочки сдвигается, как показано на рисунке ниже. Процесс тредмиллинга характерен для клеток растений, в которых отсутствуют центросомы. Тредмиллинг требует участия дополнительных белков и не происходит в растворе очищенного тубулина.
Видеосъемка небольшой области, расположенной на периферии клетки, которая экспрессирует флуоресцирующий тубулин.
Показаны четыре рамки видеоизображения, записанного в течение определенного времени.
Стрелками обозначены две индивидуальные микротрубочки.
Микротрубочка, расположенная слева, постоянно растет, в то время как правая укорачивается.
Каждая кривая показывает изменение длины микротрубочки во времени.
Линия голубого цвета показывает рост микротрубочки из очищенного тубулина in vitro.
Как видно, трубочка растет более одной минуты, затем происходит почти полная ее деполимеризация, после чего рост возобновляется.
Красным цветом обозначена кривая, отражающая рост типичной микротрубочки, находящейся в клетке.
По длине эта трубочка в несколько раз превышает образующуюся in vitro, и для нее характерно большее число переходов за тот же промежуток времени.
В отличие от системы in vitro, при каждом цикле деполимеризации трубочка укорачивается лишь частично, и иногда между состоянием роста и укорачивания наблюдается пауза.
Исследование быстрой оборачиваемости микротрубочек веретена с помощью метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP).
Представлены микротрубочки митотического веретена в клетке, которая экспрессирует флуоресцирующий тубулин.
Полюса веретена расположены вверху и внизу.
В промежутке времени между съемкой первой и второй рамок флуоресцентная метка тубулина подвергается локальному фотообесцвечиванию на участке,
расположенном поперек веретена (выделен скобками).
В течение 60 с флуоресценция в обесцвеченной области возвращается к первоначальной интенсивности.
Это свидетельствует о том, что через выделенный участок проходят новые микротрубочки, содержащие флуоресцирующие субъединицы тубулина.
Появление микроструктур является результатом постоянной сборки и разборки микротрубочек веретена.
Две кривые, описывающие изменение длины типичных интерфазных (голубая линия) и митотических (красная линия) микротрубочек во времени.
Интерфазные микротрубочки гораздо длиннее, и длина их практически не меняется причем иногда они не растут и не укорачиваются.
Длина митотических микротрубочек непостоянна, и с каждым циклом деполимеризации они сокращаются.
Из-за изменений параметров динамической нестабильности, в зависимости от фазы клеточного цикла,
митотические микротрубочки выглядят короче и более динамичны, чем интерфазные.
Фотография небольшой области вблизи края клетки, сделанная с помощью флуоресцентного микроскопа.
Ковалентно-модифицированная форма тубулина находится только в стабильных микротрубочках и отмечена зеленым цветом;
немодифицированная форма тубулина обозначена синим цветом. Непосредственно перед приготовлением препаратов для микроскопии в клетки вводили меченый тубулин,
чтобы пометить концы растущих трубочек (обозначен красным цветом).
В клетке микротрубочки окрашены либо зеленым, либо синим цветом, что указывает на существование двух отдельных их субпопуляций.
Только для синих микротрубочек характерны красные кэпы. Это говорит о том, что к стабильным микротрубочкам субъединицы не присоединяются.
В некоторых условиях на микротрубочках происходит процесс тредмиллинга,
при котором тубулиновые субъединицы преимущественно добавляются к плюс-концу микротрубочки и отщепляются на минус-конце.
Наращивание субъединиц с одного конца микротрубочки и диссоциация их с другого означает,
что происходит непрерывный «круговорот» тубулиновых субъединиц, сопровождающийся их продвижением от плюс- к минус-концу.
Это показано на примере субъединиц, обозначенных красным цветом.
Тредмиллинг является основным путем обмениваемости микротрубочек в клетках растений.
