Как указано ранее, Нозерн-блоттинг позволяет изучать размер и количество небольших наборов транскриптов, выявляемых зондами, специфичными к РНК. Такие болезни, как рак или системные аутоиммунные заболевания, тем не менее могут иметь изменения в сотнях молекул мРНК или управляющих микроРНК, и в таких ситуациях Нозерн-анализ небольшого числа генов не может обеспечить достаточной информации.
В то же время микроматрицы экспрессии РНК как мощный метод анализа предоставляют такую информацию в одном эксперименте, измеряя различия в количестве большого числа, возможно, всех транскриптов в конкретном типе клеток, ткани или стадии болезни относительно другого типа клеток, ткани или стадии болезни. Можно анализировать образцы РНК, полученные от пациентов и от контрольных групп, из клеток гистологически различающихся типов опухолей или линий клеток, обработанных и не обработанных лекарственным препаратом.
РНК для проведения анализа экспрессии сначала выделяют из клеток или тестируемой ткани и из стандартных источников РНК. Каждую РНК подвергают обратной транскрипции в кДНК. Тестируемые и стандартные образцы кДНК помечают отдельно красной и зеленой флюоресцентной краской, смешивают в равных пропорциях и проводят гибридизацию с микроматрицей (биочипом), тем же методом CGH, только что описанным для образцов ДНК.
В этом случае матрица экспрессии содержит нуклеотидные последовательности, однозначно соответствующие каждой РНК. Последовательность, уникальная для конкретной РНК, должна содержать до 25 нуклеотидов и быть частичным или полным аналогом кДНК. Коэффициент интенсивности флюоресценции двух красок в каждой точке матрицы — мера соотношения в двух образцах числа копий РНК, представленной последовательностью в данной точке.
Клинические приложения матриц экспрессии для молекулярного фенотипирования и анализа функций путей метаболизма
Простейшее применение данных матриц экспрессии — рассматривать спектр изменений в тестируемом образце РНК, как если бы он был «отпечатком пальца», характерным для тестируемого источника РНК, не обращая существенного внимания на сущность или функции конкретных генов, число копий которых увеличено, уменьшено или не изменилось по сравнению со стандартным образцом. Такие образцы экспрессии генов представляют собой молекулярные фенотипы, характеризующие различные состояния болезни.
Молекулярное фенотипирование состава мРНК и микроРНК в настоящее время используют в онкологии для разграничения гистологически сходных опухолей, обеспечивая более точный прогноз их клинически важных характеристик, например тенденции к метастазированию или ответа на лечение. Применяют также более сложный анализ матриц экспрессии, когда устанавливают участие, сначала теоретически, затем экспериментально, белков, закодированных соответствующими транскриптами и изменяющихся в течение болезни, в функциях путей метаболизма.
Таким образом, исследователи могут сделать логические выводы относительно молекулярного патогенеза болезни на основе знания того, как повреждаются в процессе болезни транскрипты генов с известными или предполагаемыми функциями. Использование матриц экспрессии РНК коренным образом изменяет исследование рака и все шире используется во всех областях патологии человека.
