• Наступление процессов клеточного цикла носит скоординированный характер
• Координация событий клеточного цикла достигается за счет специфических биохимических процессов, которые происходят в точках проверки. Точки контроля задерживают дальнейшее продвижение клетки по циклу, если не завершилось предыдущее событие
• Точки контроля необходимы, только когда клетки находятся в условиях стресса или повреждены. Однако они также могут функционировать в нормальном цикле для обеспечения координации событий
При каждом цикле митотического деления клетка удваивает и сегрегирует свою ДНК, а затем делится. Каким образом поддерживается такой порядок процессов клеточного цикла? Происходят ли нарушения этого порядка и каковы их последствия?
Как отмечалось выше, для обеспечения определенного порядка протекания процессов цикла, в клетке действует специальная система наблюдения или точек контроля. Она функционирует при изменении активности основных регуляторных факторов клеточного цикла, таких как СЕЖ и АРС.
Простые и изящные эксперименты Рао и Джонсона по слиянию клеток позволили выявить не только основные регуляторы прохождения клетки по циклу, описанные ранее, но также показали существование точек проверки. Было обнаружено, что при слиянии С2-клеток с S-фазными клетками ядра 02-клеток «ждут» S-фазных ядер для того, чтобы закончить репликацию ДНК до начала разрушения ядерной оболочки и вступления в митоз. Это позволило всыказать предположение о существовании механизма, предотвращающего наступление митоза до момента полного завершения репликации ДНК.
Представление о существовании точек контроля, регулирующих порядок наступления событий клеточного цикла и задерживающих прохождение клетки по циклу при возникновении ошибок, полностью сформировалось при характеристике мутантов почкующихся дрожжей, rad9. При отборе чувствительных к облучению клеток дрожжей было выделено несколько мутантов, которые получили название rad мутантов. Ионизирующая радиация повреждает ДНК. Ожидалось, что скрининг радиочувствительных клеток поможет обнаружить мутанты, дефектные по системе репарации ДНК.
Однако были также идентифицированы мутанты, дефектные по другим генам. При тщательном микроскопическом исследовании rad мутантов среди клеток остановившихся в цикле, были выявлены различия фентипа. После повреждения ДНК большинство rad мутантов никогда не делились. Наоборот, мутанты rad9 до момента гибели делились несколько раз, образуя микроколонии.
Такое поведение большинства rad мутантов позволило предположить, что повреждение ДНК вызывает задержку прохождения клетки по циклу, что дает время, необходимое для репарации повреждений. Однако, поскольку большинство rad мутантов обладает дефектной системой репарации, повреждения ДНК не репарируют ся, и поэтому такие мутанты необратимо останавливаются в цикле. Продолжение пролиферации мутантов rad9 в этих условиях позволяет предполагать, что у них повреждение не узнается машиной клеточного цикла. Таким образом, было высказано предположение о существовании Rad9-зависимой точки контроля, которая следит за целостностью ДНК; эта точка контроля узнает дефекты в ДНК и сигнализирует о них остановкой клеточного цикла. Для клеток дикого типа точка контроля не требуется, и она необходима, только когда нарушается целостность структуры ДНК.
Многие cdc мутанты по сигналу Rad19-зависимой точки контроля также останавливаются в цикле. Например, cdc9 мутанты, дефектные по ДНК-лигазе, необходимой для завершения репликации ДНК, останавливаются в цикле, образуя крупные почкующиеся клетки. Однако двойные мутанты cdc9rad9 не задерживаются в цикле, продолжают делиться и погибают. Таким образом, rad9 также участвует в остановке клеток в цикле, если не завершилась репликация ДНК. Сигнальный процесс, который вызывает остановку клетки в цикле при незавершении репликации, носит название точки контроля за репликацией. Рисунок ниже иллюстририрует роль rad9 в функционировании точки контроля.
Все точки контроля клеточного цикла содержат три компонента:
1) сенсор, детектирующий дефект;
2) сигнальный модуль, передающий сигнал после обнаружения дефекта, и
3) мишень, представляющую собой часть машины клеточного цикла, контролирующей процессы его остановки.
Основной принцип функционирования точки контроля, узнающей дефекты в ДНК или незавершенность ее репликации, схематически представлен на рисунке ниже.
Сигнальные системы MEN (почкующиеся дрожжи) и SIN (делящиеся дрожжи) представляют собой цепочки аналогичных процессов,
которые регулируются ГТФазой, переходящей из активной (связанной с ГТФ) в неактивную (связанную с ГДФ) форму.
Активная форма ГТФазы стимулирует каскад протеинкиназ (три киназы в MEN и четыре в SIN).
Сигнальные системы MEN и SIN обеспечивают активацию семейства фосфатаз Cdc14 и прохождение цитокинеза.
Неизвестно, участвуют ли фосфатазы в цитокинезе у обоих типов дрожжей.
Инактивация Cdc9p ДНК-лигазы при переносе мутантов Cdc9ts в условия непермиссивной температуры приводит к незавершению репликации ДНК.
Все мутанты останавливаются в цикле и приобретают вид крупных почкующихся клеток.
При выпадении в клетках функции гена Rad9p и перенесении их в условия той же температуры, видимых изменений фенотипа не наблюдается.
Однако мутанты с выключенной функцией генов Cdc9 и rad9 обнаруживают особый летальный фенотип.
Клетки не останавливаются в цикле и продолжают образовывать микроколонии нежизнеспособных клеток.
Таким образом, эти результаты показывают, что остановка роста мутантов cdc9ts связана с существованием в цикле контрольной точки, которая функционирует с участием Rad9.
После обнаружения ошибки (например, повреждения в ДНК) в клетке активируется контрольная точка.
Эта точка представляет собой последовательность событий, реализующих сигнал блокировки прохождения клетки по циклу.
Данный пример иллюстрирует события, в результате которых за счет ингибирования активации Cdk1 предотвращается вхождение клетки в митоз.
