Методы анализа изображений флюоресцентно меченных нуклеотидов. Особенности
В свое время гибридизация по Саузерну и Нозерн-блоттинг оказались полезными для исследования небольшого числа генов или их копий. Тем не менее сейчас разработаны новые и более мощные методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот, позволяющие изучать целые геномы или большие коллекции транскриптов мРНК в ходе одного эксперимента.
Методы основаны на разработках в двух областях. Во-первых, на обнаружении и обработке с высоким разрешением флюоресцентных сигналов на изображении. Эта технология позволяет попиксельно измерять уровни флюоресценции, испускаемой каждой частью изображения всей микроскопируемой области. Второй быстро развивающейся областью стала технология микроматриц.
Позаимствовав методы полупроводниковой промышленности, исследователи разработали и изготовили миниатюрные матрицы или «биочипы», на которых небольшие количества нуклеиновых кислот размещены в плотном двумерном массиве из сотен тысяч точек площадью не более нескольких квадратных сантиметров. Состав нуклеиновых кислот в каждой точке может колебаться от олигонуклеотидов длиной в 25 пар оснований до ВАС-клонов размером в 350 килобаз.
После гибридизации такой матрицы с комплементарными зондами, меченными флюоресцентными красителями, каждую точку изучают под флюоресцентным микроскопом. При этом регистрируют излучение, испускаемое зондом, что позволяет определить его количество.
Если зонд содержит смесь из двух флюоресцентных красок, испускающих свет с разной длиной волны, анализируют яркость по каждой длине волны и вычисляют относительный вклад каждого красителя в общее излучение.
