Сайты ДНК с повышенной чувствительностью к ДНКазе (нуклеазе)
• В промоторных областях экспрессируемых генов находятся сайты, обладающие повышенной чувствительностью к нуклеазе
• Они возникают при связывании с ДНК факторов транскрипции, которые удаляют октамеры гистонов
Наряду с изменениями общего характера, которые происходят в активных или потенциально активных областях хроматина, модификации структуры происходят на специфических сайтах, связанных с инициацией транскрипции или со специфическими структурными переходами в ДНК. Эти изменения были впервые обнаружены при переваривании ДНК ферментом ДНКазой I, взятым в очень низкой концентрации.
При обработке хроматина ДНКазой I вначале в специфических гиперчувствительных сайтах двойной спирали образуются разрывы. Поскольку чувствительность к ДНКазе I отражает доступность ДНК в хроматине, мы считаем, что эти сайты отражают области хроматина, в которых ДНК особенно подвержена атаке фермента, поскольку она не организована в обычную нуклеосомную структуру. Обычно гиперчувствительные сайты в 100 раз более чувствительны к ДНКазе I, чем основной хроматин. Эти сайты также чувствительны к действию других нуклеаз и химических агентов.
Гиперчувствительные сайты возникают за счет (тканеспецифических) изменений структуры хроматина. Их локализацию можно установить методом гибридизаци-онной концевой метки, который мы обсуждали выше в связи с установлением позиционирования нуклеосом. Процедура схематически представлена на рисунке ниже.
Под действием ДНКазы I происходит расщепление по гиперчувствительному сайту. После этого измеряется расстояние до другого конца фрагмента, который образуется под действием рестриктазы.
Метод непрямого концевого мечения позволяет определять расстояние между сайтами гиперчувствительности к ДНКазе и к рестриктазе.
За счет существования специфического сайта чувствительности к ДНКазе I образуется фрагмент ДНК,
длина которого соответствует расстоянию между сайтом гиперчувствительности к ДНКазе и сайтом рестрикции.
Большинство гиперчувствительных сайтов связаны с генной экспрессией. Каждый активный ген обладает одним или несколькими чувствительными сайтами, расположенными в области промотора. Большинство гиперчувствительных сайтов находится в хроматине только тех клеток, в которых происходит экспрессия генов. Если гены не проявляют активность, гиперчувствительные сайты не регистрируются. 5'-ги-перчувствительные сайты образуются перед началом транскрипции, и первичная структура ДНК в этих областях связана с экспрессией генов. Это можно продемонстрировать, исследуя соответствующие мутанты.
Наиболее полно исследован сайт чувствительности к нуклеазе, расположенный на мини-хромосоме SV40. Короткий фрагмент, расположенный у участка начала репликации, выше позднего промотора транскрипции, преимущественно расщепляется ДНКазой I, микрококковой нуклеазой и другими нуклеазами (включая рестриктазы).
Мини-хромосому SV40 можно исследовать в электронном микроскопе. Примерно у 20% исследованных препаратов отмечается «брешь» в нуклеосомной организации хроматина. По краям этого промежутка, составляющего в длину 120 нм (около 350 пн), расположены нуклеосомы, и он представляет собой область, чувствительную к нуклеазной атаке. Это доказывает, что повышенная чувствительность области хроматина к нуклеазам связана с отсутствием в ней нуклеосом.
На протяжении сайта может наблюдаться различная чувствительность к нуклеазам. На рисунке ниже представлена карта двух сайтов гиперчувствительности.
В пределах промежутка, порядка 300 пн, в SV40 находятся два гиперчувствительных сайта к ДНКазе I и «защищенная» область. По-видимому, в этой области с ДНК связаны (негистоновые) белки. Первичная структура ДНК, соответствующая этой области, связана с элементами, необходимыми для функционирования промотора.
Сайты b-глобинового промотора проявляют повышенную чувствительность к ряду ферментов: ДНКазе I, ДНКазе II и к микрококковой нуклеазе. Места атаки ферментов располагаются в пределах одной области на некоторых расстояниях друг от друга. Так, в транскрибируемом гене нуклеазы преимущественно атакуют область протяженностью от -70 до -270 пн.
Какова структура гиперчувствительной области? Ее доступность к нуклеазам указывает, что она не защищена октамером гистонов, однако это не свидетельствует о том, что она вообще не содержит белков. Нуклеазы атакуют участок свободной ДНК. Каким образом ДНК может лишиться нуклеосом? Мы предполагаем, что гиперчувствительные сайты образуются при связывании специфических регуляторных белков с ДНК, которые исключают нуклеосомы. Действительно, связывание таких белков, вероятно, служит причиной существования защищенных областей в пределах гиперчувствительного сайта.
Белки, участвующие в образовании гиперчувствительных сайтов, вероятно, относятся к различным регуляторным факторам, поскольку эти сайты обнаруживаются в пределах промоторов, а также прочих регуляторных элементов: в участке начала репликации, в центромере и в прочих местах. В ряде случаев они локализованы в участках с более сложной организацией хроматина. Гиперчувствительный сайт может ограничивать область позиционированных нуклеосом. Гиперчувствительные сайты, связанные с транскрипцией, могут образовываться при связывании транскрипционных факторов с промоторами, чем достигается доступность последних для РНК-полимеразы.
Нуклеосомная организация мини-хромосомы SV40 характеризуется существованием промежутка.
В промежутке минихромосомы SV40 находятся гиперчувствительные сайты, чувствительные области,
а также защищенный регион ДНК. Гиперчувствительный сайт в гене b-глобина цыпленка содержит сайты чувствительности к нескольким нуклеазам.
