• Инициация репликации ДНК представляет собой ключевую контрольную точку клеточного цикла бактерий
• Репликация происходит в двух направлениях, начиная от фиксированной точки, называемой oriC
• Процесс реликации организован в специальные «фабрики»
• Белки рестарта репликации обеспечивают прохождение вилок от точки начала до точки терминации
• На кольцевых хромосомах обычно присутствует ловушка, обеспечивающая схождение репликативных вилок в точке терминации
• Для кольцевых хромосом необходимы специальные механизмы, координирующие терминацию репликации с декатенацией, разделением димера хромосомы, сегрегацией и клеточным делением
• Белок SpoIIIE завершает процесс сегрегации хромосомы, транспортируя захваченные участки ДНК из области, ограниченной септой деления
Репликация хромосомы у бактерий начинается в некоторой фиксированной точке, называемой oriС (точке начала репликации) и имеет двунаправленный характер, т. е. репликативные вилки одновременно движутся по часовой стрелке и в противоположном направлении. Процесс репликации характеризуется высокой процессивностью, и репликативные вилки встречаются в точке, расположенной диаметрально противоположно oriC, которая называется terC (точка окончания репликации).
Репликация происходит в дискретных сайтах, называемых фабриками репликации, в которых накапливаются субъединицы аппарата репликации. Исследование функционирования фабрик репликации в клеточном цикле B. subtilis показало, что в одной фабрике происходит один раунд репликации. Таким образом, образование примерно одного участка меченого белка репликации соответствует одному раунду репликации ДНК. Эти данные противоречат традиционной точке зрения о том, что репликативные вилки отходят от точки начала, oriC, в двух противоположных направлениях. Вместо этого предполагается, что обе вилки расположены рядом. При такой локализации возможно, что обе вилки могут иметь общий пул субъединиц белков репликации, и даже общий пул предшественников ДНК — нуклеотидтрифосатов.
С учетом такой локализации репликативных вилок, предложена модель общей организации репликации ДНК в клетке. На начальном этапе репликации хромосомы репликативная фабрика связывает область, содержащую oriC. С противоположных сторон репликативного комплекса появляются новореплицированные копии oriC, и обе репликативные вилки располагаются вместе. По мере прохождения репликации, нереплицированный участок хромосомы поступает на фабрику репликации в середине клетки, а новореплицированная ДНК выходит к противоположным полюсам. Области, содержащие oriС, сегрегируют у противоположных полюсов клетки. Область terC локализуется в середине клетки, в плотной массе нереплицированной ДНК. В конце концов происходит репликация области, содержащей terC, завершается раунд репликации хромосомы, и фабрика репликации прекращает свое существование.
Флуоресцентная микрофотография, показывающие положение фабрик репликации в делящихся клетках.
Клетки экспрессируют конъюгат зеленого флуоресцирующего белка и DnaE, субъединицы холофермента ДНК-полимеразы.
При данных условиях роста в каждой клетке находятся два реплицирующихся нуклеоида,
в каждом из которых находится центральная фабрика репликации.
Модель, описывающая функционирование фабрики репликации, помогает объяснить удивительную процессивность репликации ДНК in vivo. Репликативные вилки редко проходят путь от начала репликации до ее окончания без перерывов. Остановка репликации может объясняться повреждениями в ДНК или задержкой функционирования РНК-полимеразы. В бактериальной клетки существуют много механизмов, которые позволяют возобновить движение репликативных вилок до или после репарации поврежденной цепи ДНК. Сборка всех этих белков в непрочный комплекс вместе с новосинтезированными цепями ДНК могла бы способствовать восстановлению продвижения репликативных вилок и обеспечить их надлежащее функционирование до момента завершения репликации.
Прекращение репликации ДНК выдвигает ряд топологических проблем для клеток бактерий, имеющих кольцевые хромосомы.
• Во-первых, репликативные вилки, сходящиеся в одной точке, генерируют много положительных супервитков, для снятия которых необходимы топоизомеразы.
• Во-вторых, завершенные хромосомы должны быть скручены (катенированы), что также требует участия различных топоизомераз.
• В-третьих, при рекомбинации между сестринскими хромосомами могут образоваться димеры, которые до момента сегрегации должны быть превращены в мономеры.
Эти проблемы решаются с помощью специальных белков, присутствующих в клетках бактерий.
Когда происходит задержка репликативной вилки, и она не достигает точки окончания, возникает опасность того, что вторая вилка, продвигающаяся по другой хромосоме, пройдет через эту точку и будет продолжать движение по другой половине хромосомы. Белки прекращения репликации контролируют сайт terC, блокируя прохождение вилок в неправильном направлении. В результате репликативные вилки вынуждены встретиться в определенной области хромосомы, где клетка может управлять последующими процессами разделения димера и декатенации. Декатенация, по-видимому, осуществляется при действии специальной топоизомеразы, Торо IV. В разделении димера участвует система сайт-специфической рекомбинации, которая включает гетеродимерную каталитическую резольвазу (XerCD) и сайт мишени dif локализованный в терминальном домене.
При образовании димера хромосомы происходит спаривание двух dif сайтов, и XerCD разрезает и обменивает две нити хромосом, образуя два отдельных кольца. Очевидно, что эта система нуждается в каком-то способе разграничения димерных и мономерных хромосом, и она должна действовать только на димеры (поскольку при рекомбинации мономеров образуется димер!) Пространственное разделение молекул ДНК у Е. coli, по-видимому, находится под контролем белка FtsK, который выполняет несколько функций на поздних стадиях клеточного деления. Во-первых, он необходим для образования септы деления. Во-вторых, FtsK способен транслоцировать ДНК. За счет этого, при попадании ДНК в область, ограниченную септой деления, она может выходить оттуда. При этом может достигаться более близкое расположение двух сайтов dif в димерной хромосоме, и возможно, что смысл переноса ДНК состоит в том, чтобы обеспечить такое расположение этих сайтов. В-третьих, при необходимости FtsK активирует XerCD рекомбиназу. Это приводит к разделению димера и обеспечивает распределение по клеткам новых сестринских мономерных хромосом. Наконец, FtsK взаимодействует также с топоизомеразой IV, которая принимает участие во всех прочих процессах, связанных с декатенацией хромосом.
Модель репликации кольцевой хромосомы, которая учитывает близкое расположение двух репликативных вилок в фабрике репликации.
Одна цепь ДНК обозначена синим цветом; комплементарная ей цепь — красным.
Новореплицированные цепи ДНК обозначены более темным оттенком.
